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Communications Biology volume 5、記事番号: 803 (2022) この記事を引用

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6 引用

3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

脊髄損傷（SCI）の治療法として、神経幹/前駆細胞（NS/PC）移植への期待が高まっています。しかし、移植された細胞が宿主の神経回路に組み込まれ、運動機能の回復に寄与するかどうか、またどのように寄与するかは依然として不明である。このプロジェクトの目的は、神経移植片の活動を視覚化するための新しい非侵襲性生体内イメージングシステムを確立することであり、それによって移植片と宿主の間の回路レベルの統合と、宿主の行動に対する移植片神経活動の寄与を同時に実証することができます。。我々は、強力な神経活動依存性合成プロモーターである強化シナプス活動応答エレメント（E-SARE）の制御下にある新たに改変したルシフェラーゼであるAkalucをNS/PCに導入し、その細胞をSCIモデルマウスに移植した。このシステムの使用により、移植された細胞の活動が宿主の行動と統合され、宿主の神経回路入力によって駆動されることがわかりました。この非侵襲システムは、SCIに対する細胞移植治療の治療メカニズムの解明に役立つことが期待されます。

脊髄損傷（SCI）は、運動麻痺、感覚麻痺、自律神経麻痺などの重度の神経機能障害を引き起こします。近年、損傷した脊髄の再生を促進する細胞移植療法を開発する多くの試みが行われている。神経幹/前駆細胞 (NS/PC) は、そのような治療法にとって最も有望なリソースの 1 つです 1、2、3。移植された NS/PC 由来ニューロン、アストロサイト、希突起膠細胞による細胞置換など、いくつかの推定上の根底にあるメカニズムが示唆されています。栄養サポート。および軸索再髄鞘形成4、5、6。さらに、いくつかの研究は、NS/PC 移植片が脊椎切断部位を横切る神経中継を形成できること、つまり宿主の吻側部分から移植片への入力と移植片から尾側部分への出力を組み合わせることができることを提案しています。これらのプロセスは機能回復において主要な役割を果たしていると考えられています。しかし、神経中継の詳細な特徴付けは行われておらず、移植片がどのように宿主の神経回路に機能的に統合されるかについてはほとんど理解されていない。これは主に、移植片細胞の活性と宿主の挙動および回路レベルの活性との間の関係を直接監視できる技術が現在の技術にないためである。機能的な宿主と移植片の調整を解明し、移植片が宿主の神経回路活動や宿主の行動にどのような影響を与えるかを評価するには、生きた宿主内で移植片ニューロンの活動を経時的に監視するための新しい非侵襲的な生体内イメージング技術が必要です。

このような生体内モニタリングシステムを実現するために、私たちは 2 つの新しい技術に焦点を当てました。 1 つ目は、AkaBLI システム (AkaLuc 酵素と透過性の高い基質としての AkaLumine-HCl の組み合わせ) でした 10,11。生物発光イメージング (BLI) は、生きた動物にルシフェリン (基質) を投与した後、酵素ルシフェラーゼを発現する細胞からの光出力を測定する非侵襲的な方法です。 AkaBLI は、明るい発光スペクトルを生成し、生きた動物の深部組織イメージングを可能にする新開発の赤方偏移 BLI システムです10。これは、損傷した脊髄の移植細胞からの遺伝子発現の広視野非侵襲モニタリングに最適です。 2 つ目は、強力なニューロン活動依存性合成プロモーターである強化シナプス活動応答要素 (E-SARE) でした 13。ニューロンが活性化すると、脊髄ニューロンであっても、Fos、Arc、Egr1 などの前初期遺伝子 (IEG) のスイッチがオンになり、IEG のプロモーター/エンハンサーは活性依存性レポーターシステムとして使用されます 14,15。これらのプロモーターの中には合成プロモーター E-SARE があり、これは Arc プロモーターの SARE エンハンサー要素に基づいており、他の既存の IEG プロモーターよりも大幅に優れたニューロン活動依存性遺伝子発現を駆動します。

この研究では、AkaBLI と E-SARE 技術を組み合わせて、生体内で移植片の神経活動を視覚化するための新しい非侵襲的システムを確立しました。私たちは、損傷した脊髄に移植されたNS/PC由来細胞の活性アンサンブル動態を画像化することに成功しました。このシステムを用いて、移植片の活性が宿主の行動と関連しており、ホストの回路が移植片の活性を制御していることを確認しました。

神経活動を可視化するための生物発光に基づくシステムを確立するために、我々はまず、Arc エンハンサーから生成される強力な神経活動依存性プロモーターである E-SARE の制御下で、赤方偏移生物発光に最適化されたルシフェラーゼである AkaLuc を発現するためのレンチウイルスベクターを構築しました。要素（図1a）。私たちはこのシステムを ESAL (E-SARE-AkaLuc) と名付けました。 ESAL システムでは、同時に蛍光標識するために AkaLuc を Venus タンパク質と融合し、融合タンパク質の半減期を短縮するために PEST 配列と融合しました 16。 Venus タンパク質は、Aequorea victoria 由来の黄色蛍光タンパク質 (YFP) を含む変異であり、急速な成熟と環境耐性の増加を引き起こします 17。次に、ESALレンチウイルスベクターをヒト誘導多能性幹細胞（iPSC）由来のNS / PC（ESAL-NS / PCとして同定）にトランスフェクトし、細胞のニューロンへの分化を誘導しました（図1b〜h）。脱分極濃度の塩化カリウム（50 mM）で刺激すると、ESAL-NS/PC由来ニューロンは、刺激されていないコントロールと比較してAkaLuc光子数の有意な増加を示しました（図1b、c）。また、50 mM KCl刺激によるVenus蛍光とIEG発現の増加も検出しました（図1d、e）。したがって、ESALシステムはニューロンの脱分極刺激に対して非常に敏感であるが、非ニューロン細胞ではほとんど反応を示さないことを確認しました（図1f-h）。これらのデータは、ESAL システムを使用して NS/PC 由来ニューロンのニューロン活動を首尾よく監視できることを示唆しています。

プロモーターE-SAREの制御下でVenus融合AkaLuc発光酵素を発現するために使用される、E-SARE-Venus-AkaLuc（ESAL）構築物の概略図。ニューロンが活性化されると、プロモーター E-SARE が下流のレポーター遺伝子 Venus-AkaLuc の高発現を引き起こしました。 b 50 mM KClで6時間刺激したインビトロ培養細胞（右側、n = 4）または刺激なし（左側、n = 4）の比較生物発光イメージング（BLI）。同じ胚様体（EB）からの 2 つの独立した三次ニューロスフェアから n = 8 ウェルを準備しました。バーの色は、生物発光の総放射輝度 (光子/秒/cm2/str) を示します。ステラジアン (str) は立体角の単位です。 c in vitroで50 mM KClを添加した場合または添加しない場合のESAL-NS / PC由来細胞の相対BLIシグナル強度の定量分析（各n = 4）。値は平均値 ± 平均値の標準誤差 (SEM): **p < 0.01。両側対応のないスチューデントの t 検定を実行しました。 T 値と自由度: t (6) = 11.59、p = 2.5 × 10−5。 d in vitroで50 mM KClを添加した場合と添加しない場合のESAL-NS/PC由来細胞の顕微鏡明視野画像およびVenus蛍光画像。スケールバー、50μm。 e 上記と同じウェル内の細胞におけるVenus、ARC、およびFOSの遺伝子発現のqPCR分析の結果（それぞれn = 4）。値は平均値 ± SEM: *p < 0.05、**p < 0.01。両側対応のないスチューデントの t 検定を実行しました。個々の t 値と自由度: Venus t(6) = 3.034、p = 0.023。弧 t(6) = 2.705、p = 0.035。 Fos t(6) = 7.057、p = 4.1 × 10−4。 f、g 50 mM KClの添加の有無にかかわらず、汎胎児性致死的視覚異常（汎ELAVL）（ニューロン）について染色されたNS / PCからのVenus発現分化細胞の代表的な画像（f）。 50 mM KCl を添加して、ヒトグリア線維性酸性タンパク質 (GFAP) (アストロサイト)、2’, 3’ - サイクリックヌクレオチド 3’-ホスホジエステラーゼ (CNPase) (希突起膠細胞)、ネスチンおよび Ki-67 (未成熟細胞) を染色しました (g)。スケールバー、20μm。 h 50 mM KClで刺激した後のVenus+細胞のうち、細胞型特異的マーカーに対して陽性の細胞の割合。

ESALシステムの時間分解能をプロファイルするために、活動電位の発火を促進し、グルタミン酸作動性伝達を増強する神経刺激（4-アミノピリジン[4AP] + ビククリン[BIC]）の短い試合後の生物発光の時間経過を調べました（補足図1）。 1a)。ニューロン活動依存性の生物発光は、刺激の約4時間後に検出され、6時間でピークに達し、24時間で基礎レベルに戻りました（補足図1b）。これらの結果は、ESAL システムにおける生物発光の増加が、BLI 測定前の 4 ～ 10 時間の範囲の期間に持続した累積的なニューロン活動を反映していることを示しています。

次に、NOD/ShiJic-scidJcl (NOD-SCID) マウスに脊髄レベルの C5 背柱切断を行い、損傷の 9 日後に移植を行いました。脊髄損傷後の急性炎症は治まり、グリア瘢痕形成はまだ完了していないため、現時点では宿主環境が移植に最も適していると考えました18、19、20、21。 ESAL-NS/PCを損傷部位に移植しました（図2a、f）。体重によって正規化された握力とIBBスコアは、PBSグループよりもTPグループで大幅に改善されたことがわかりました（補足図2a、b）。ただし、水平ラダーテストのエラー率には、回復に関連する大きな変化は見つかりませんでした（補足図2c）。

a ポジティブコントロールマウスの概略図。 2つのウイルス（hM3DqとmCherryの融合タンパク質を含むCAG-hM3Dq-mCherry、およびESALをレンチウイルスを介してNS/PCに形質導入した）で二重感染したNS/PCの移植を、C5背柱切断の9日後に実施した。移植の6週間後、屠殺する前に発光測定を実施した。 b ESAL発現NS / PC移植（ESAL-NS / PC移植）マウス間のBLIシグナル強度の比（CNO後7時間/CNO前）の比較（hM3Dq [−] TP、n = 4）および二重感染 NS/PC 移植マウス (hM3Dq [+] TP、n = 3) を示します。値は平均値 ± SEM: *p < 0.05。両側対応のないスチューデントの t 検定を実行しました。 T 値と自由度: t(5) = 3.977、p = 0.011。 c ポジティブコントロールマウスの代表的なIVIS画像（CNO前およびCNO後）。円は頸椎の関心領域 (ROI) を示します。バーの色は、生物発光の総放射輝度 (光子/秒/cm2/str) を示します。 d、e 移植後6週間のポジティブコントロールマウスの代表的な画像。 Venus (緑)、mCherry (赤)、および HNA (ヒト細胞) (青) で標識されたもの (d)、または Venus (緑)、Fos (赤)、および HNA (青) で標識されたもの (e)。スケールバー、20μm。 f in vivo 実験の概略図。 ESAL-NS/PCの移植は、C5後柱切断の9日後に実施されました。移植後 3、6、9 週間後に発光測定を実施しました。移植の10週間後にすべてのマウスを屠殺した。 g Venus (緑色)、pan-ELAVL (赤色、矢印)、および HNA (青色) で標識された ESAL-NS/PC 移植マウスからの移植細胞の代表的な画像。スケールバー、20μm。 h 移植後3、6、および9週間後のESAL-NS / PC移植マウスの移植片発光強度の時間依存的変化（n = 12マウス）。値は平均値 ± SEM: *p < 0.05。 NS: 重要ではありません。反復測定 ANOVA を実行しました。個々の p 値: 3 週目と 6 週目。 0.1735、6週目と9週目。 0.2007、第 3 週と第 9 週。 0.0035。 iVenus (緑色)、APC (希突起膠細胞)、GFAP (アストロサイト)、Ki-67/Nestin (赤色、矢印)、および HNA (青色) で標識された ESAL-NS/PC 移植マウス組織からの移植細胞の代表的な画像。スケールバー、20μm。

移植細胞のニューロン活動を人為的に操作するために、我々は、刺激性化学遺伝学的受容体であり、デザイナー薬物によってのみ活性化されるデザイナー受容体（DREADD）である hM3Dq を導入しました。これにより、リガンド 22,23 を ESAL-NS/ に投与すると移植片が活性化されるようになりました。 PC (図 2a)。 hM3DqリガンドであるクロザピンN-オキシド（CNO）の投与によって移植片が活性化されると、生物発光が大幅に上方制御されました（図2b、c）。一貫して、免疫組織化学分析では、Venus タンパク質発現は hM3Dq 発現細胞でのみ検出されましたが、mCherry+ 移植細胞は CNO 活性化時に主に Venus タンパク質を発現しました（図 2d）。レンチウイルスのトランスフェクション効率が非常に高いためにこれが起こったことを確認するために、in vivoでレンチウイルスベクターを介したESALおよびDREADDのNS/PCへのトランスフェクション効率を計算しました。まず、ユビキタスプロモーター下での hM3Dq のトランスフェクション効率、つまりヒト好中球抗原 (HNA) + 細胞のうちの mCherry + 細胞の集団は 90.0 ± 1.1% でした (図 2d、補足図 2d) (n = より) 3匹）。第二に、遍在性CNO活性化下のmCherry+細胞のうちVenus+mCherry+二重陽性細胞の集団に従ってESALの発現効率を近似した。 Venus + mCherry + / mCherry + パーセンテージは、83.9 ± 2.5% であると決定されました (図 2d、補足図 2d) (n = 3 匹の動物から)。全体として、トランスフェクション効率は生物発光の結果を解釈するのに十分に高いと考えられました。これと一致して、Fos タンパク質は神経活動によって直ちに上方制御され、短命な転写因子であるにもかかわらず、Venus + 細胞は Fos、マーカー、および IEG に対して免疫陽性であることがよくありました（68.9 ± 3.0%）（図 2e）。。これらのデータは、ESAL システムが SCI モデルマウスに移植されたニューロンの活性アンサンブルを首尾よく標識したことを示唆しています。

ヒトELAVL（Hu）陽性神経細胞の割合は、Venus陽性細胞の中で非常に高かった（76.2±8.6％）（補足図2e）。 hM3Dqによる人為的な活性化がなくても、神経移植片の一部でVenusの発現が見られました（図2f、g）。この発見は、ESAL システムが移植片内で自発的な活動を示すニューロンを報告する可能性があることを示唆しています。これは、ESAL-NS / PC移植後に時系列的に測定されたESAL生物発光上昇の時間経過と一致しており、NS / PCの神経分化と成熟の進行が生物発光検出の大幅な増加に先行することを示唆しています（図2h）。この考えと一致して、Venus発現を示すグリア細胞はほとんどないことを確認しました（GFAP+/Venus+、4.0±1.5％、APC+/Venus+、3.3±2.5％）（図2i）。

以前の報告では、宿主の神経管が損傷した後、移植されたニューロンが統合され、神経管内の回路の一部になることが示唆されています9,26。 ESAL システムを使用して、神経移植片の活動に対する宿主の活動の影響を個体レベルおよび回路レベルで調べました。まず、ESAL 生物発光を 1 日にわたって監視したところ、ESAL 生物発光は正午頃に最も高く、夜間に最も低いことがわかりました（補足図 3）。 ESAL生物発光が観察の約6時間前の累積的なニューロン活動を反映していることを考えると（補足図1a、b）、この結果は、移植片ニューロンの活動には、夜間と日中の宿主動物のピークとトラフの活動と一致する日内変動があることを示しています、それぞれ。宿主の活動が個体レベルで移植片の活動にどの程度影響を与えるかをさらに判断するために、次に、長期麻酔（ミダゾラム、塩酸メデトミジン、ブトルファノールの組み合わせ）を利用して睡眠を模倣しました（図3a）。マウスの呼吸数から、麻酔は投与後少なくとも 6 時間は有効であることが示唆されました。麻酔時間を9時間に延長するために、残りの3時間にイソフルランを追加投与しました。 ESAL 生物発光は、長期麻酔後、初期レベルのほぼ半分に減少しました (図 3b、c)。この減少は、移植後 6 週間と 9 週間の両方で顕著でした (図 3c)。さらに、我々は、体外培養ニューロンを使用して、3種類の麻酔薬の混合物が移植ニューロンの活性を直接変化させることができないことを確認しようとしました。実際、BLI シグナル強度は麻酔薬によって顕著に減少しませんでした (図 3d、e)。総合すると、これらのデータは、移植片ニューロンの活動が個体レベルでの宿主の日常活動と関連していることを示唆しています。

長期持続麻酔の概略図。麻酔は 3 種類の麻酔薬 (ブトルファノール、塩酸メデトミジン、ミダゾラム) の混合物で達成され、その後、最長 9 時間の吸入麻酔が行われました。 b 移植後10週間の長期連続麻酔前後のESAL-NS / PC移植マウスの代表的なIVIS画像。円は頸椎の関心領域 (ROI) を示します。バーの色は、生物発光の総放射輝度 (光子/秒/cm2/sr) を示します。 c 移植後6週間および9週間のBLIシグナル強度（連続麻酔前および9時間後）の比（n = 5マウス）。値は平均値 ± SEM: *p、#p < 0.05。両側の対応のあるスチューデントの t 検定を実行しました。個々の t 値と自由度: 6 週目と 9 週目。 t(8) = 2.754、p = 0.025、6 週目。 t(8) = 2.502、p = 0.037、9 週目。 t(8) = 4.456、p = 2.1 × 10−3。 d 2つの異なる濃度、12/3/10μM（「低濃度」）および30/7.5μMの混合麻酔薬を添加した場合（n = 4）または添加しなかった場合（n = 4）のインビトロ培養細胞のBLIの比較。 /25 μM (「高濃度」)、6 時間 (n = 4、各 4)。同じ EB からの 2 つの独立した三次ニューロスフェアから n = 8 ウェルを準備しました。バーの色は、生物発光の総放射輝度 (光子/秒/cm2/str) を示します。 e in vitroでの混合麻酔薬の添加ありまたはなしのESAL-NS / PC由来細胞の相対BLIシグナル強度の定量分析（それぞれn = 4、4）。値は平均値±SEM: NS: 有意ではない。両側の対応のないスチューデントの t 検定を実行しました。個々の t 値と自由度: 左: t(6) = 0.342、p = 0.744、右: t(6) = 1.821、p = 0.118。

次に、宿主回路レベルの活動が移植片ニューロンの活動を直接調節するかどうか、またどの程度調節するかを調査しました。我々は、感覚運動制御において極めて重要な役割を果たす主要な下行回路の1つである皮質脊髄路（CST）に焦点を当て、hM3Dq-mCherryをコードするアデノ随伴ウイルス（AAV）を運動皮質に注射することによりCST活性を人為的に操作した。ヒトシナプシンIプロモーターの制御（図4a）。 AAV注射の3〜4週間後27、hM3Dq-mCherryがCSTを介してC5病変部位への効率的な順行性標識を可能にしたことを確認しました（図4b）。病変部位へのCST投影のこの選択的標識は、CST線維が移植片を神経支配していることを示唆しました（図4c、補足図5）。実際、宿主から移植片へのシナプスが形成されていることがわかりました（図4d–g、補足図6a–c）、これは移植片のCST駆動制御を示しています。これを直接テストするために、hM3DqリガンドCNOの投与によってCSTが活性化され、免疫組織化学分析によって移植片細胞におけるAkaLucと融合したVenusの発現の活性誘発性の増加が検出されました（図4h-j）。さらに、CNO処理時の人工CST刺激によって誘発される移植片活性の増加は、移植片のESAL光子数の増加を通じてBLI測定によって生体内でも確認されました（図4h、k、l）。これらの結果は、宿主の CST 入力が神経支配し、移植片の活性を調節していることを示唆しています。

in vivo実験のタイムスケジュールを表す概略図。 ESAL-NS/PC の移植から 6 週間後、マウスの運動皮質に AAV を注射しました。移植から 10 週間後、屠殺する前に発光測定を実施しました。 b 大脳皮質のmCherry標識細胞体（スケールバー、250μm）および髄質（スケールバー、500μm）および1/2レベルの頸髄（スケールバー、100μm）のmCherry標識軸索の確認）。 mCherry+ CST 軸索端は C5 病変領域の吻側の灰白質で観察され (スケールバー、250 μm)、病変の尾側には CST 軸索はほとんど観察されませんでした (スケールバー、250 μm)。 R:右、L:左、D:背側、V:腹側。 c 損傷した脊髄周囲の正中矢状面から 400 μm の代表的な矢状画像。移植細胞を STEM121 (ヒト特異的細胞質マーカー) で染色し、CST を mCherry で標識しました。破線、移植片の吻側境界、R: 吻側、C: 尾側、D: 背側、および V: 腹側。スケールバー、5μm。 d CST軸索と移植されたニューロンの間のシナプス形成の高倍率図。シナプス前マーカーのシナプトフィジンは mCherry と融合し、STEM121+ 細胞に隣接していました。スケールバー、2 μm。 e CST軸索と移植されたニューロンの間のシナプス形成の高倍率図。シナプス後マーカー pAMPAR は STEM121 と融合し、mCherry+ 細胞に隣接していました。スケールバー、2 μm。 f 各移植グループの STEM121+ 領域に統合された mCherry と結合したシナプトフィジン + シナプスの定量化を示す棒グラフ (CST 活性化グループ、20 画像/n = 4; CST 非活性化グループ、20 画像/n = 4)。値は平均値 ± SEM: *p < 0.05。両側対応のないスチューデントの t 検定を実行しました。 T 値と自由度: t(38) = 0.128、p = 0.90。 g 3,3'-ジアミノベンジジン四塩酸塩 (DAB) 染色された mCherry+ CST ニューロンと Immunogold 染色された Venus+ 移植片ニューロンの間のシナプス接続の二重免疫電子顕微鏡画像。抗 mCherry 標識は CST ニューロンの膜に局在しており、Venus タンパク質は主に細胞質膜で黒い点として検出できました。矢じり、シナプス後密度。スケールバー、500 nm。 h 宿主CSTがC5脊髄損傷部位の神経幹細胞移植片に入力されることを示す概略図。 CST ニューロンが hM3Dq を介して活性化されると、再生された CST 軸索と相互接続された移植片ニューロンはプロモーター E-SARE を獲得することができ、下流のレポーター遺伝子 Venus-AkaLuc の高発現を促進します。 R: 吻側、C: 尾側、D: 背側、V: 腹側。 i CST活性化の有無にかかわらず、マウスの組織におけるVenusおよびHNA染色の代表的な軸頸髄画像。示されているセクションは、吻側尾軸に沿って同じ順序で抽出されたものです。スケールバー、1000 μm。 Venus は細胞質タンパク質であり、HNA は抗核抗原です。 j 移植グループ間の計算された Venus+ 体積/HNA+ 体積の比較 (CST 活性化グループ、n = 4; CST 非活性化グループ、n = 4)。抗 GFP 抗体を使用して Venus タンパク質を標識しました。値は平均値 ± SEM: *p < 0.05。両側対応のないスチューデントの t 検定を実行しました。 T 値と自由度: t(6) = 2.573、p = 0.042。 k CST活性化前後のESAL-NS/PC移植マウスの代表的なIVIS画像（図4i[右]に示す同じ個体）。円は頸椎の関心領域 (ROI) を示します。バーの色は、生物発光の総放射輝度 (光子/秒/cm2/str) を示します。 l 移植後10週間の各マウスのCST活性化ありまたはなしのESAL-NS/PC移植マウスのBLIシグナル強度の比較（n = 10マウス）。値は平均値 ± SEM: **p < 0.01。両側対応のあるスチューデントの t 検定を実行しました。 T 値と自由度: t(18) = 2.963、p = 8.3 × 10−3。

移植後どれくらいの時間が経過すると、移植されたニューロンを神経支配するためにCST入力が増加しますか? この疑問に答えるために、CST ニューロンによって神経支配されている移植片の生物発光を縦方向に測定しました。興味深いことに、シグナル対ノイズ比（CST活性化後/CST前）は、3週目から9週目と6週目から9週目で大幅に増加し、特に6週目以降、宿主のCST入力が神経支配し、移植片の活性を調節していることを示唆しています（補足図） .4a)。

CNO 投与後の ESAL 活動の経時変化はどのように行われますか? 神経活動に対する全身性 CNO 投与の初期効果は 5 ～ 10 分後に始まり、CNO 投与後 45 ～ 50 分でピークに達します 28,29,30。この in vitro 研究で明らかになったタイムラグが、ESARE プロモーターの駆動から ESAL のレポータータンパク質発現のピークまで 6 時間であることを考慮すると、上記のすべての測定は CNO 投与の 7 時間後に実行されました（補足図 4b）。検証のために、CNO 投与の 4、7、および 10 時間後に ESAL 光子数測定を実行し、異なる日に同じ個体の動物を追跡しました。 in vitro 研究結果と一致して、初期状態ごとの平均光子数の比率は、3 つの時点 (4、7、および 10 時間) の中で 7 時間で最も高くなりましたが、4 時間での光子数の比率の差は大きくありませんでした。初期状態あたりの h および 7 h は有意ではありませんでした (補足図 4c)。

今回我々は、高感度で正確な赤方偏移生物発光であるAkaBLIと神経活動依存性プロモーターE-SAREを組み合わせた、新しいバイオイメージングシステムESALを開発した。この ESAL システムは、損傷した脊髄の神経移植片内の活性ニューロンを効率的に標識します。この非侵襲的 ESAL イメージングシステムを使用することにより、移植片の活動と宿主の回路/行動レベルの活動の間の直接的な関連性を実証しました。

この研究の結果は、ESAL システムが損傷した脊髄における移植片活動の in vivo イメージングのための非侵襲的方法であることを実証しています。 ESAL システムは自発的なニューロン活動を画像化し、移植片と宿主の神経回路間の相互作用を明らかにすることができます。いくつかのグループは、電気生理学的 31 またはカルシウムイメージング技術 9 を使用して SCI モデルにおける宿主と移植片の接続性を報告しましたが、彼らの実験は生きた SCI 動物では行われませんでした。対照的に、ESAL システムは完全に非侵襲的な方法で使用でき、睡眠や長期麻酔などの個人レベルでの宿主の活動が移植片の活動に直接影響することを in vivo で示しました。

ニューロンリレーは、NS/PC 移植を SCI の治療に使用できる中心的なメカニズムです9,31,32。中継回路は、宿主の下行軸索と移植された NS/PC から新たに分化したニューロンとの間に確立できます。しかし、非侵襲的な in vivo 測定方法の欠如により、神経移植片がどのように機能的に宿主回路に統合されるか、また移植片の活動がどのように行動回復に寄与するかについての解明は不可能であった。当社の ESAL システムは、さまざまな宿主の行動に関連して移植片の活動をモニタリングすることができ、神経中継形成のメカニズムとその機能回復への寄与の解明につながります。

NS/PC 由来細胞の生物発光強度は移植後 9 週間まで継続的に増加しており、これは自発的移植片活性が付随して増加していることを示唆しています。これは、移植片におけるニューロンの成熟には 6 週間以上必要であることを示唆した、我々のグループの以前の研究と一致しています 33。ヒト iPSC 由来の脳オルガノイドを使用したいくつかの報告でも、シナプス形成と自発的活動が 4 ～ 6 週間で始まることが示されています 34。他者の発見と私たち自身の発見に基づくと、ESAL システムの結果は、生体内でのニューロンの成熟とシナプス形成を反映している可能性があります。

異なる地域的アイデンティティを持つ NS/PC のどのサブタイプが細胞治療に最も適しているかについては、依然として議論が続いています 31,35,36。 ESAL システムにより、ホストに統合されたさまざまな NS/PC サブタイプの品質と適合性を判断できるようになります。移植片がさらなる組織再生と運動機能の回復にどのように寄与するかは、依然として解明されていない。これまでの報告では、γ-セクレターゼ阻害剤 (GSI) による前処理が Notch シグナル伝達を阻害することにより NS/PC 由来ニューロンの成熟を促進することが示されています 21。さらに、Nogo 受容体アンタゴニストは縫線脊髄路の再生を促進し 37、一部のシナプス形成因子が促進することが示唆されています。シナプス形成38．このシステムは、NS/PC 移植片および損傷した脊髄周囲の宿主回路に対するこれらの分子成分の影響を評価するのにも役立ちます。

したがって、この ESAL システムは、運動機能回復における各下行経路から移植ニューロンへのシナプス入力の寄与を明らかにする可能性を秘めています。 CST の機能には、求心性入力、脊髄反射、運動ニューロン活動の制御が含まれます 39。さらに、CST は人間の随意運動の主要な運動経路として一般に認識されています 40。げっ歯類では、CST はデジタル屈筋を含む握力のみを指令しますが、これは主に背側および背外側 CST、ならびに水平梯子または熟練した到達タスクに依存します 41,42。以前の研究によると、げっ歯類の運動機能にとって、赤核脊髄路または網状脊髄路の方が CST よりも重要である可能性があります 43,44。このシステムを用いて移植部位を検証し、細胞治療の効果を高めることができれば興味深い。

結論として、この研究は、移植された細胞由来のニューロンをモニタリングするための新しい in vivo システムを導入し、移植片の活性と宿主のニューロン回路および挙動との間の関連性の重要性について重要な情報を提供する。我々は、SCIに対するNS/PC移植後に宿主と移植片のシナプス接続が機能的に確立されることをin vivoで実証した。細胞療法を改善する 1 つの方法は、この接続性をさらに強化することです。ニューロンの成熟またはシナプス形成を促進することで、将来的にはこのシステムによる細胞治療がより効果的になる可能性があります。

CST/移植片の活性化と移植片活性の記録は両方とも、hM3Dq と ESAL のウイルス発現に依存していました。トランスフェクション/発現効率の差異は、宿主 CST 内での移植細胞の組み込みの分析に影響を与える可能性があります。トランスフェクション効率が低いと、ESAL 活性に関する結果の解釈が難しくなる可能性もあります。 CST は運動制御に寄与する主な構成要素ですが、神経の可塑性が変化すると考えられていないことを考えると、1 回の CST 刺激ではマウスの行動を改善するのに十分ではないことを我々は認識しています。代わりに、CST の連続的な hM3Dq 刺激は、シナプス活動を強化する回路/行動活動の同時改善を達成する可能性があります 45,46。さらに、CST-DREADD によって CST 機能を不活化することは、宿主と移植片の接続性の証拠を提供するのに役立つと考えられます 47。

このシステムは進行中のニューロン活動のリアルタイム評価を提供するものではなく、効果を示すには数時間にわたって活動を増加させる必要があり、累積的なニューロン活動を反映することに注意することが重要です。時間分解能を向上させる 1 つの解決策は、細胞内カルシウム濃度などのリアルタイムのニューロン活動の指標を利用することです。実際、カルシウム依存性ルシフェラーゼシステムである Orange CaMBI が報告されています 48。ただし、このシステムは NanoLuc-フリマジンに基づいており、血液脳関門を通る基質透過性が低いため、神経移植には適さない可能性があります 49,50。別の可能な解決策は、Fos プロモーター 51 などの別の活性依存性プロモーターの使用です。これは、Fos タンパク質による Fos 転写の自己抑制のため、非常に低いレベルで制御される一般的に使用される活性依存性プロモーターです 52,53。したがって、Fos プロモーター依存性発現を増幅するには、通常、テトラサイクリン 10 による転写活性化により tet 誘導性システムが追加されます。しかし、この Fos-tet ダブルレポーターシステムは遺伝子発現にかなりの時間を必要とします。対照的に、ESAL システムは、移植片モニタリングに単独で使用できるほど十分に高いレベルでレポーター発現を駆動し、比較的短期間で遺伝子発現を達成します。

我々は主に宿主下行ニューロンと移植片との間の宿主−移植片結合に焦点を当ててきたが、移植片と運動ニューロンなどの宿主脊髄ニューロンとの間の移植片−宿主相互作用を評価するにはさらなる研究が必要である。 ESAL システムは、サイズが小さいため単一の AAV にパッケージ化できるため、AAV を使用することで移植片だけでなく宿主ニューロンにも利用できます。例えば、AAV 逆行性ウイルスベクターを神経筋接合部にトランスフェクトすることにより、脊髄運動ニューロンの活動を検出することは可能です 54。今後の研究により、宿主と移植片の間の相互作用についての理解が深まるでしょう。

ESAL、E-SARE プロモーター (参考文献 10 に記載、東京大学大学院医学系研究科神経化学教室の H. Bito からの要請に応じて入手可能)、および Venus-AkaLuc-PEST cDNA 用のレンチウイルスベクターを構築するには(理研 BRC [バイオリソースセンター] から MTA とともに受け取ったプラスミドから取得) をレンチウイルスベクター CSII にクローン化しました。ユビキタス DREADD 活性化のためのレンチウイルスベクターを構築するために、hM3Dq-mCherry cDNA を pAAV-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry (Addgene プラスミド #50474) からポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 増幅し、CAG を使用してレンチウイルスベクター CSIV に移しました。これは、サイトメガロウイルス (CMV) エンハンサーとニワトリベータアクチンプロモーターが融合したハイブリッド構築物です 55。

組換えレンチウイルスベクターは、3 つのプラスミドの HEK 293T 細胞への一過性トランスフェクションによって生成されました: pCAG-HIVgp、pCMV-VSV-G-RSV-Rev、およびレンチウイルスベクター CSII-E-SARE-Venus-AkaLuc-PEST または CSIV-CAG- hM3Dq-mCherry56,57,58。

iPS 細胞研究応用センター (CiRA) は、適正製造基準 (GMP) 条件下で生成および維持されたヒト人工多能性細胞 (iPSC) を私たちに提供してくれました。 NS/PC は、以前に記載された方法 21、33、60 によってヒト iPSC 株 414C259 から生成されました。簡単に説明すると、414C2 ヒト iPSC をマウス胎児線維芽細胞 (MEF) との接着培養で 12 日間培養しました。次に、30 日間浮遊培養した iPSC から胚様体 (EB) を生成しました。次に、TrypLE Select (Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州、米国) を使用して EB を単一細胞に解離し、KBM 神経幹細胞培地 (Kohjin Bio、埼玉、日本) に 1.0 × 105 細胞/ml の密度で懸濁液中で分化させました。 B-27 (Thermo Fisher Scientific)、20 ng/ml FGF-2 (PeproTech、ニュージャージー州、米国)、および 10 ng/ml ヒト白血病阻害因子 (hLIF; Merck KGaA、ヘッセン、ドイツ) を 12 日間投与しました。 FGF-2 を 3 日ごとに添加し、すべての細胞培養培地を 6 日ごとに交換しました。これらの初代ニューロスフェアは、上記と同じ方法で解離することにより 10 ～ 14 日ごとに継代されました。最初の継代後、レンチウイルス感染を 3 日間培養し、三次ニューロスフェアを次の実験に使用しました。計算されたトランスフェクション効率を考慮して、定量的 PCR (qPCR) によるレンチウイルス力価とフラスコあたりの総細胞数に基づいて、NS/PC の MOI (感染多重度) 値を 6.7 (ESAL) および 2.7 (hM3Dq) に調整しました。実験を通して一貫していました。力価測定は、製造業者（Takara Bio、滋賀県、日本）の指示に従って、qPCR ベースのレンチウイルス力価アッセイによって実行されました。

E17 マウスの大脳皮質から抽出したマウス星状細胞フィーダー細胞を、ポリ D リジン (Sigma-Aldrich) でコーティングした 24 ウェルチャンバーガラススライド上にプレーティングしました。フィーダー細胞を 5% CO2、95% 空気中 37 °C で 3 ～ 7 日間培養しました (5 × 104 細胞/ウェル)。 TrypLE Selectを使用して解離した四次ニューロスフェアを、星状細胞フィーダー層でプレコートしたチャンバーガラススライド上に1×105細胞/ウェルの密度でプレーティングしました。細胞は、B-27 Plus Supplement (Thermo Fisher Scientific)、GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific)、Culture One Supplement (Thermo Fisher Scientific)、 L-アスコルビン酸 (200 μM) (Sigma-Aldrich)。神経刺激アッセイでは、塩化カリウムを 50 mM の濃度で添加し、培地中に 6 時間放置しました。ニューロンサイレンシングアッセイでは、3 つの薬剤の混合物（ブトルファノール [Vetorphale]、Meiji Seika ファルマ株式会社、東京、日本、メデトミジン塩酸塩 [ドミトール]、日本全薬工業株式会社、福島、日本、ミダゾラム）、ＳａｎｄｏｚＫＫ、東京、日本）を２つの濃度で添加した：１２／３／１０μＭ（低濃度）および３０／７．５／２５μＭ（高濃度）６１、６２。

8週齢の雌NOD-SCIDマウス（オリエンタル酵母工業株式会社、東京、日本）にSCIまたは偽手術を行った（SCI前のSCIマウスの体重は15.92〜20.55gの範囲であった）。運動機能に対する移植の治療効果を判定するために、30 匹の動物をランダム抽選法 (つまり、 1 ～ 30 の番号が付いた個々の紙片を箱に入れ、各グループごとに紙片をランダムに引きました: TP グループ、n = 14、PBS グループ、n = 12、偽グループ、n = 4)。 TP グループには 1 週目に AAV を注射し、縦方向の発光測定を受けました（TP および PBS マウスの体重は、0 週目で 15.07 ～ 19.69 g、3 週目で 15.00 ～ 20.75 g、6 週目で 16.26 ～ 22.86 g、 9週目では17.14〜22.43 g）。さらに、一部の TP マウス (n = 12) には、TP の 6 週間後に SCI、TP、および AAV 注射を事前に受けました。 10週目にのみ発光測定を実施しました。ESALおよびhM3Dq形質導入NS/PC移植マウス（hM3Dq [+] TP、n = 5）は両方とも6週目にポジティブコントロール測定を受けました（データはn = 3で利用可能でした）。対照的に、他の TP マウス (hM3Dq [-] TP、n = 5) は 6 週目にネガティブコントロール測定を受け (データは n = 4 で利用可能)、6 週目と 9 週目に移植片に対する長時間の麻酔の影響の評価を受けました。すべての動物実験は慶応大学の倫理委員会によって承認され、実験動物の管理と使用に関するガイド（米国メリーランド州国立衛生研究所）に従って実施されました。

8週齢の雌NOD-SCIDマウスを、ケタミン(60mg/kg)およびキシラジン(10mg/kg)の腹腔内注射によって麻酔した。ケタミン以外の追加の鎮痛剤は投与されなかった。イソフルラン (1 ～ 2%) と O2 を使用した吸入麻酔下で、C4 レベルの椎弓板を切除し、硬膜の背側表面を露出させました。タングステンワイヤーナイフ (McHugh Milieux、David Kopf Instruments、カリフォルニア州、米国) を背側表面から 0.6 mm 挿入し、0.5 mm 持ち上げて後柱を横断しました 31。損傷の9日後、10μlハミルトンシリンジおよび定位固定マイクロインジェクター（KDS 310;室町機械、東京、日本）（ESAL-NS/PC 移植マウス、合計 n = 31、ESAL および hM3Dq 形質導入 NS/PC 移植マウス、n = 5）。注射後、注射器を注射部位に２分間放置した後、取り外した。代わりに、等量のPBSを対照マウス(PBS群マウス、n = 12)に注射した。偽マウスは、C4頚椎の椎弓切除術を受けた(偽グループマウス、n = 4)。マウスをデジタル加熱プレート上に置くことにより、体温を37℃に維持した。我々は、手術日とSCI翌日に動物に12.5 mg/kgのアンピシリンを筋肉内投与した。前肢の動きにマイナスの影響があったにもかかわらず、動物は自力で餌や水にアクセスできたため、SCI後は集中治療は行わなかった。動物は10週間の追跡期間中飼育され、その後屠殺された。 ESALおよびhM3Dq形質導入NS/PC移植マウス（hM3Dq [+] TP; n = 3; 2匹の動物は6週間前に死亡）の場合、期間は6週間であった。

移植実験では、前述のように移植の前日にガンマセクレターゼ阻害剤 (GSI) 治療を適用しました 21。簡単に説明すると、NS/PC を小分子 GSI、N-[N-(3,5-ジフルオロフェンアセチル)-L-アラニル]-S-フェニルグリシン t-ブチルエステル (DAPT; Sigma-Aldrich、ミズーリ州、米国) とともに培養しました。、損傷部位への移植の１日前に、最終濃度１０μＭでＤＭＳＯに溶解した。

以下の分析は、3 週目、6 週目、および 9 週目に実施されました。行動実験中、実験者には常に治療グループを知らされていませんでした。

握力テストは、前肢の機能を評価する方法として受け入れられています。細胞移植または PBS 注射後の運動機能の回復は、動物が引っ張る力を発揮する能力に基づいて評価されました 63,64,65 (TP グループ; n = 13、PBS 注射グループ; 最後の時点で n = 10) 9週目）。試験は 5 回の別々のプルから構成されていました。最も高い力と最も低い力は除外され、残りの 3 つの力は平均化されました66。筋力測定も体重によって分けられました67,68。握力テストは、デジタルフォースゲージ（新保社、京都市）および金網取り付け装置（室町機械社）を使用して実施した。

前肢の障害、特に CST 機能を評価するために、アーバイン、ビーティーズ、ブレスナハンの食物操作課題の方法にわずかに変更を加えてマウス IBB スコアを使用しました 69,70,71。簡単に言うと、SCI後10日間、マウスを毎日環境に順応させた。ドーナツ型の蜂蜜風味のシリアル（ハニーナッツチェリオス、ミネソタ州、米国）を与え、前肢の動きをホームケージ内でカメラ（GoPro、カリフォルニア州、米国）で120 f/sで記録しました（TPグループ、n） = 13; PBS 注射グループ、n = 10; 偽グループ、9 週目の最終時点で n = 4)。

水平はしご（米国マサチューセッツ州コンダクトサイエンス）の歩行課題では、不規則な間隔の横木における足の配置を測定しました72,73。熟練した歩行を評価するために、各横断時のエラーをカウントしました。 SCIの前に、マウスを慣れさせるために、1日20分の規則的な横木パターンを5日間使用してマウスを訓練しました。カメラ (GoPro) をわずかに腹側の角度に配置して、4 つの手足すべてを 60 f/s で記録しました。不規則な間隔の横木のパターンは、動物がパターンを学習し、学習によって障害を補うことを防ぐために、3週間ごとに変更されました。開始は、マウスが四肢すべてを段に置いた時間として定義され、終了は、マウスがはしごの最後の段に到達した時間として定義されました。中断後の最初のステップは得点されませんでした。

CST の活性化が 10 週目に神経移植片の活性を変化させるかどうかを厳密に調査するために、AAV2-hsyn-hM3Dq-mCherry (Addgene #50474-AAV2; 7.38 × 1012 vg/ml) を両側感覚運動野の 4 部位に注射しました (500 nL)。 /ポイント; 座標 = ブレグマの吻側 1 mm および側方 1.4 mm、ブレグマの後方 1 mm および側方 1 mm; 深さ = 0.7 mm) を、引っ張りガラス製マイクロピペット (校正済みマイクロピペット、1) を介して 100 nL/分の速度で6 週目に –5 μL; 船越、東京、日本）（予備 ESAL-NS/PC 移植マウス [n = 12]）。上肢の動きと CST 活性化後の移植片活性の変化との関連を調べるために、AAV2-hsyn-hM3Dq-mCherry を両側感覚運動野の 2 か所に注射しました (500 nL/点、座標 = 吻側 1 mm、側方 1.4 mm)。 1週目でブレグマまで;深さ = 0.7 mm）（縦方向発光測定用のESAL-NS/PC移植マウス[n = 14]）。 CNO (Enzo Life Sciences、ニューヨーク州、米国) を 5 mg/kg の濃度で腹腔内投与しました。 CSTを操作するために、合計26匹のESAL-NS/PC移植マウスにhM3DqによるCST軸索の順行性標識を施した。宿主 CST と移植片間の統合の分析に含めるには、CST 軸索が免疫組織化学に従って正常に切断および標識される必要があり、移植片が BLI フォトンカウンティングによって頚椎上で明確に検出される必要がありました (3 週目、6 週目)。、および9)。予備の 12 匹の動物のうち、1 匹の動物は最終測定前に死亡したため除外され、1 匹の動物は CST 標識が不十分だったために除外されました (n = 10 利用可能)。縦方向の 14 匹の動物のうち、2 匹の動物は死亡のため除外され、2 匹の動物は CST 標識が不十分のため除外されました (n = 10 利用可能)。免疫組織化学的所見によれば、CST 切断は他のすべてのマウスで成功したと考えられました 74。

生物発光画像は、IVIS Spectrum システム (Perkin Elmer、MA、USA) を使用して取得しました。インビトロ培養ニューロンについては、300 μM AkaLumine-HCl (富士フイルム和光純薬、大阪、日本) で処理した直後に生物発光を測定しました。二重感染 NS/PC 移植マウスは 6 週目に画像化されました。ESAL-NS/PC 移植マウスは、吸入麻酔下 (2% イソフルランと酸素) または麻酔下で 6 週目と 9 週目、または 10 ～ 11 週目に画像化されました。 3 種類の麻酔（ブトルファノール 5 mg/kg、塩酸メデトミジン 0.75 mg/kg、ミダゾラム 4 mg/kg）の混合物 75 を 9 時間投与し、続いて 2% イソフルランと酸素を吸入（発光測定は 3 週目に評価）、6、9 時間の麻酔なし）。一連の各実験では、すべてのマウスについて 1 日の同じ時間に測定を実行しました。 hM3Dq 活性化のために、すべての動物において、測定の 7 時間前に CNO 溶液を注射しました。 50μlのAkaLumine-HCl(60mM)および生理食塩水を腹腔内注射した後、シグナルを15分間測定した。関心領域 (ROI) は頸髄の直上に設定され、ほとんどの場合約 10 分で観察されるピーク強度が記録されました。測定パラメータは次のとおりです。露出時間 = 1 秒、ビニング = 8、視野 = 13.4 cm、f/絞り = 1; 生体内; 露光時間 = 60 秒、ビニング = 8、視野 = 23 cm、および f/ストップ = 1。すべての画像は Living Image ソフトウェア (IVIS Imaging Systems、バージョン 4.5.5) で処理され、信号強度が表されます。フォトン/秒/cm2/ステラジアンの単位でのフォトン数として。各結果は、グレースケールの解剖学的画像に重ねられた擬似カラーのフォトンカウント画像として表示されます。

E17 マウス胚から単離した海馬組織を小片に切り分け、10 単位/ml パパイン (ナカライテスク、東京、日本) および 0.01% DNase I (Sigma-Aldrich) を含む PBS で 37 °C で 15 分間消化しました。次に、海馬ニューロンを、ポリ-L-リジンでコーティングされた24ウェルプレート上で、B27 PlusおよびGlutaMAXを含むNeurobasal Plus Mediumで培養しました（3×105細胞）。細胞を DIV5 でレンチウイルス-E-SARE-Venus-AkaLuc-PEST に感染させ、DIV7 で TTX (1 μM、Tocris、ブリストル、英国) でサイレンシングし、次に 4AP (250 μM、Tocris) およびビククリン (50 μM) で刺激しました。、Sigma-Aldrich）、以前の研究の方法に従って、TTX の非存在下で DIV8 で 10 分間実験しました 13,76。刺激後、長時間の刺激を抑制するために、1 μM TTX を含む培地でニューロンを再度沈黙させました。指定された時点 (短い刺激から 0、2、4、6、8、10、および 24 時間後) で、300 μM AkaLumine-HCl での処理直後に、IVIS Spectrum システムを使用して生物発光画像を取得しました。

RNeasy Micro Kit (Qiagen, Inc.、ヒルデン、ドイツ) を使用して全 RNA を抽出し、ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (東洋紡績株式会社、ライフサイエンス部、大阪、日本) を用いた逆転写によって cDNA を合成しました。）。 qPCR は、Step One Plus 機器 (Applied Biosystems、カリフォルニア州、米国) を製造業者の指示に従って使用して実行しました。各遺伝子の発現レベルは、比較ΔΔCT法を使用してACTBの発現レベルに対して正規化されました。ヒト DNA 配列に対して次の製造プライマー (Thermo Fisher Scientific) を使用しました: FOS (Hs01119266_g1)、ARC (Hs01045540_g1)、および ACTB (Hs03023943_g1)。さらに、EGFP (Mr00660654_cn) を使用して Venus 発現を検出しました。

インビトロ培養細胞を 4% パラホルムアルデヒド (PFA) で 15 分間固定しました。損傷の 10 週間後に、すべてのマウスに深く麻酔をかけ、経心的に 4% PFA を灌流しました。脳および脊髄を解剖し、4% PFA中で2日間後固定した。次に、固定した脊髄を 0.1 M PBS 中の 10% スクロースに 4 °C で一晩浸し、続いて 30% スクロースに浸しました。解剖した脊髄を最適切断温度化合物（Sakura Finetek、東京、日本）に包埋し、クライオスタット（Leica Biosystems、Wetzlar、ドイツ）上で厚さ 12 μm で軸面で切断しました。サンプルは次の一次抗体で染色されました: 抗 GFP (ヤギ IgG、1:500、ロックランド、ペンシルバニア州、米国)、抗 mCherry (ウサギ IgG、1:400、アブカム、ケンブリッジ、英国)、抗汎胎児性致死抗体異常視覚様（ELAVL）（マウス IgG1、1:200、Sigma-Aldrich）、抗 GFAP（ウサギ IgG、1:2000、プロテインテック、イリノイ州、米国）、抗 APC（マウス IgG2b、1:300、アブカム） )、抗ヒト GFAP (マウス IgG1、1:2000、タカラバイオ)、抗 CNPase (マウス IgG1、1:2000、Sigma-Aldrich)、抗 Ki-67 (ウサギ IgG、1:2000、Leica Biosystems) 、抗ネスチン (ウサギ IgG、1;200、IBL、群馬、日本)、抗 HNA (マウス IgG1、1:100、ミリポア、ダルムシュタット、ドイツ)、抗 Fos (ウサギ IgG、1:400、アブカム) 、抗ヒト汎ELAVL（ヒトIgG、1:1000、米国ニューヨーク州ロックフェラー大学のロバート・ダーネル博士からの寄贈）、抗シナプトフィジン（マウスIgM、1:100、ミリポア）、抗汎ELAVL AMPAR (モルモット、1:500、フロンティア研究所、北海道、日本)、および抗 STEM121 (マウス IgG1、1:200、タカラバイオ)。核は Hoechst 33258 (10 μg/ml、Sigma-Aldrich) で染色されました。すべての画像は、蛍光顕微鏡 (BZ-X710; Keyence、大阪、日本/THUNDER Imager Live Cell; Leica、ドイツ) または共焦点レーザー走査顕微鏡 (LSM 780; Carl Zeiss、Jena、ドイツ) を使用して取得されました。

SCI および移植後の組織切片の定量分析が実施されました 35。 Venus+ ボリューム (移植片活性)/HNA+ ボリューム (ヒト細胞) の三次元解析は次のように実行されました。 ESAL形質導入NS/PC移植および4部位での順行性標識を受けた8匹の動物から軸切片を調製し(4匹のマウスはCNO投与の7時間後に屠殺され、4匹のマウスはCNOなしで屠殺された)、Venus+領域およびHNA+領域はImageJ を使用して決定されます。次に、体積は次の式で計算されました。

ここで、A1 と A2 は 2 つの連続するセクションの面積、h はそれらの間の距離 (480 μm) です。

CST 軸索と移植ニューロンの間のシナプスの定量化は、ImageJ (ver. 2.1.0/1.53.c) を使用してカスタマイズされたマクロと組み合わせて実行されました。 STEM121+ 領域に統合された mCherry 標識 CST 軸索終末と融合したシナプス前マーカー (シナプトフィジン) の数をカウントしました。

事前包埋免疫電子顕微鏡分析に使用される詳細な手順は、以前に説明されています77。簡単に説明すると、スライドガラス上の凍結脊髄切片を解凍し、乾燥させ、クエン酸緩衝液（pH 6.0）中でオートクレーブ滅菌した後、ブロッキング処理（0.1 M PB中の0.01％サポニンを含む5.0％ Block Ace [DS Pharma Biomedical、大阪、日本]溶液）を行った。。サンプルは、一次抗体の抗 GFP (ヤギ IgG、1:100、Rockland) および抗 mCherry (ウサギ IgG、1:100、Abcam)、および二次抗体の抗ウサギビオチン (ロバ IgG、1:800) で染色されました。、ジャクソンイムノリサーチ、ペンシルベニア州、米国）。 PBS で洗浄した後、Alexa Fluor 488—FluoroNanogold™ 結合ウサギ抗ヤギ IgG 抗体 (1:100、Nanoprobes、ニューヨーク州、米国) を適用してから、Hoechst 33258 で染色しました。以下のサプリメントを使用しました。 ABC 複合体 (VECTASTAIN Elite ABC Kit; Vector、CA、米国）、TSA Plus ビオチン（NEL749A001KT; PerkinElmer、MA、米国）、SA-Alexa Fluor 555（1:1000、Thermo Fisher Scientific）、SA-HRP（1:100、Vector）、および 3,3 '-ジアミノベンジジン（DAB）錠剤（富士フイルム和光純薬）。ダイヤモンドナイフで超薄切片（厚さ 80 nm）を作成し、銅メッシュグリッド（#100 または #150 Veco、日新 EM、東京、日本）上に収集し、プラスチックチューブ中で酢酸ウラニルとクエン酸鉛で 10 分間染色しました。それぞれ。切片を透過型電子顕微鏡 (TEM、JEM-1400Plus、日本電子、東京、日本) を使用して 100 keV で検査しました。

2 つのグループ間の比較には、両側スチューデント t 検定を使用しました。図2hおよび補足図4a、cのデータの分析には、反復測定ANOVAが使用されました。補足図2a〜cのデータの分析には、二元配置反復測定ANOVAが使用されました。すべての統計分析において、差は p < 0.05 で有意であるとみなされました。すべてのデータは平均値 ± SEM として表示されます。全ての計算には、SPSS Statistics (日本 IBM、東京、ver. 26) を使用しました。 SAS ソフトウェア (SAS Institute, NC, USA. ver. 9.4) も反復測定 ANOVA に使用しました。これは探索的研究であったため、十分ではなかった可能性のある適度な数のサンプルを使用しました。適切なサンプルサイズは、CRAB SWOG 統計ツール計算ツール (https://stattools.crab.org) を利用して計算されました。研究の主要エンドポイントは、TP後10週間におけるCST活性化前からCST活性化後までの移植片BLI光子数の変化であった(図4l)。図４ｌのデータセットを用いて行われた事後検出力分析により、ｎ＝１１匹の移植マウスが検出力０．８（片腕正常）で主要エンドポイントを満たすのに十分であることが判明した。コーエンの d を計算して、効果の大きさを測定しました。 d 値が >0.878,79 の場合、効果サイズは大きいと定義します。補足図2のPBSグループと偽グループのサンプルサイズは、握力テストを主要エンドポイントとして使用して、研究前に決定されました。アプリオリな検出力分析により、合計 n = 27 匹のマウスで検出力 0.8 (Two Arm Normal) で十分であることが明らかになりました。 IBB および水平ラダー分析は二次的なものと考えられました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

ソースデータは補足データ 1 として含まれています。調査結果を裏付ける残りのデータは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

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著者らは、414C2 ヒト iPSC を提供していただいた CiRA (京都大学) の山中聡氏に感謝します。技術的および概念的なご指導をいただいた慶応義塾大学精神科の田中和也氏に感謝いたします。実験にご協力いただきました東京慈恵会医科大学再生医療講座の岡野博司氏、長谷川正史氏に感謝いたします。統計上のアドバイスをいただいた慶応義塾大学予防医学・公衆衛生学教室の佐藤 Y. 氏と長島 K. 氏に感謝いたします。ご協力をいただきました三好博司氏、野里晋司氏、辻修志氏、伊藤晋司氏、星野裕也氏、谷本裕基氏、柴田哲也氏、橋本晋也氏、末松祐樹氏、西條裕也氏、西島達也氏に感謝いたします。、T. 田中、K. 伊藤、L. 田尾、および K. 中西、全員が慶応義塾大学整形外科学・生理学教室の脊髄研究チームのメンバーです。また、実験と動物の世話にご協力いただきました原田哲也氏、安武和久氏、秋澤正樹氏に感謝いたします。この作業は、日本医学研究開発機関（AMED）（GrantNos。Nos。JP20BM0204001、JP19BM0204001、JP20BK0104017、およびJP19BK01017、HOおよびMNへのJP19BK01017; GrantNo。JP20BM0704046からSSおよびGrantNo。HB18DM036;日本学術振興会（JSPS）（科研費番号 22H03205 NN、17H06312 HB）、日本損害保険協会（平成 30 年度医学研究助成金 KA）

〒160-8582 東京都新宿区信濃町35 慶応義塾大学医学部整形外科

Kentaro Ago, Narihito Nagoshi, Takahiro Kitagawa, Momotaro Kawai, Keita Kajikawa, Reo Shibata, Yasuhiro Kamata, Kota Kojima, Morio Matsumoto & Masaya Nakamura

〒160-8582 東京都新宿区信濃町35 慶応義塾大学医学部生理学教室

Kentaro Ago, Kent Imaizumi, Takahiro Kitagawa, Momotaro Kawai, Munehisa Shinozaki, Takahiro Kondo, Jun Kohyama & Hideyuki Okano

理化学研究所脳科学総合研究センター細胞機能・動態研究チーム〒351-0198 埼玉県和光市広沢2-1

Satoshi Iwano & Atsushi Miyawaki

理化学研究所脳科学総合研究センター高次脳機能分子解析研究チーム〒351-0198 埼玉県和光市広沢2-1

Masanari Ohtsuka

〒113-0033 東京都文京区本郷7-3-1 東京大学大学院医学系研究科神経化学教室

Haruhiko Bito

〒444-8585 愛知県岡崎市明大寺西郷中38 生理学研究所ウイルスベクター開発室

Kenta Kobayashi

〒951-8510 新潟県新潟市中央区旭町通1-757 新潟大学大学院医歯学総合研究科顕微鏡解剖学分野

Shinsuke Shibata

〒160-8582 東京都新宿区信濃町35 慶応義塾大学医学部電子顕微鏡研究室

Shinsuke Shibata & Tomoko Shindo

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KA、NN、KI、T. 近藤、MS、SS、JK、MM、MN、HO が実験を設計しました。実験を行ったのは、KA氏、北川哲也氏、MK氏、梶川和也氏、RS氏、YK氏、KK氏、TS氏です。 SI、AM、MO、HB、および K.小林は、プラスミドまたはウイルスベクターを調製しました。 KA と他の著者全員が最終原稿を準備しました。

Correspondence to Narihito Nagoshi or Hideyuki Okano.

MN は、K-Pharma とのコンサルタントとしての役割と、RMic、久光からの研究資金提供を宣言しました。 HO は、慶応義塾大学大学院医学系研究科で指導的地位にあると宣言し、サンバイオ株式会社および K ファーマ株式会社の有償科学コンサルタントを務めています。他の著者はすべて、競合する経済的利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。主な編集者: Ivo Lieberam、Anam Akhtar、Karli Montague-Cardoso。

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転載と許可

吾郷和也、名越直也、今泉和也他脊髄損傷後の生体内神経移植片の活動を監視する非侵襲的システム。 Commun Biol 5、803 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-03736-8

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受信日: 2021 年 9 月 12 日

受理日: 2022 年 7 月 18 日

公開日: 2022 年 8 月 10 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03736-8

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