微生物マットの組成と局在パターンはサンゴにおけるブラックバンド病の毒性を説明する

npj Biofilms and Microbiomes volume 9、記事番号: 15 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

サンゴのブラックバンド病（BBD）は、独特の帯状の微生物マットを特徴とし、組織全体に広がり、感染したコロニーを死滅させることがよくあります。微生物マットはシアノバクテリアが大半を占めていますが、一般に硫化物酸化細菌 (SOB)、硫酸還元細菌 (SRB)、およびその他の微生物も含まれています。 BBD 内の移動速度は、温度、光、pH などの環境条件によって異なります。ただし、移動速度の変動が BBD マット内の微生物コンソーシアムの違いを反映しているかどうかは不明のままです。今回我々は、微小スケールの表面構造、細菌組成、空間分布がBBD病変ごとに異なる遊走速度で異なることを示す。遊走速度は、マット内の中間層に局在するアルコバクテリア科に属する潜在的な SOB の相対存在量と正の相関があり、ロドバクテリア科に属する他の潜在的な SOB の相対存在量と負の相関がありました。私たちの研究は、BBD の微生物組成が毒性の重要な決定要因であることを強調しています。

シアノバクテリアは、多くの場合、自然環境において微生物マットを形成する重要な生物です。シアノバクテリアマットの顕著な特徴は、その重層構造と、さまざまな栄養微生物が分布する特定の層です。最上層は通常、好気性シアノバクテリア、珪藻、その他の酸素性光栄養生物が優勢であるのに対し、最下層はさまざまな嫌気性細菌が優勢です。シアノバクテリアマットは、干潟、高塩分池、温泉、潮間帯、サンゴ礁などの陸上および水生環境で発生します1、2、3。バクテリアの垂直方向の分布は日々変動する可能性があり4、マットは水平方向に放射状に拡大する可能性があります5。

サンゴ黒帯病（BBD）は、シアノバクテリアが優勢な暗い色の微生物マットを特徴とし、生きたサンゴ組織を直線的に移動する独特の帯形状を示します（図1）。特徴的な黒い帯は生きているサンゴ組織の上を移動し、その結果、下にある組織の溶解と壊死が起こり、裸のサンゴの骨格が残ります6。一見正常なサンゴ組織と新たに露出した骨格との間の黒い帯の幅は、数ミリメートルから 7 センチメートルの範囲に及ぶ可能性があります 7,8。 BBD の移動速度は、最大 2 cm/日 9 と記録され、温度 10,11、光 10,11、pH12、およびさまざまな地理的条件によって変化します 13。単一のサンゴ礁内では、移動速度の 5 倍もの差異が同時に発生しました14。

Montipora sp.を囲む代表的なBBD。コロニー (a)。生きたサンゴ組織（健康な領域）と露出したサンゴの白い骨格（裸の骨格）の間のシアノバクテリアのマットで構成された黒いバンドを示す界面の拡大図（b）。

多微生物マットのバイオマスは、それぞれインド太平洋、カリブ海、紅海で同定された糸状ラン藻属オシラトリア属、ロゼオフィラム属、シュードオシラトリア属によって占められています15。これらのシアノバクテリアは単系統系統に属し、BBD 病変で一貫して見られ、BBD の病因において重要な役割を果たしていることが示されています 15。 BBD 病変の他の一般的な微生物構成要素は、SOB (例、Beggiatoa spp16 および Rhodobacterales17)、SRB (例、Desulfovibrio18 および Desulfobacteraceae19)、いくつかの多様な従属栄養細菌 15、および古細菌 20 です。シアノバクテリアは微生物マットの上部に位置しています。昼間は下部にSOB、SRB、従属栄養細菌が見られます。そして、SOBを含む好気性細菌は夜間にシアノバクテリア層の上を移動します15。この特別な分配のためのメカニズムが提案されています。日中のシアノバクテリアの活動により、酸素の動的な垂直微小勾配が生じます8,21。夜間、マット内に低酸素環境が形成され、マット下の無酸素状態でSRBが増殖・活性化する8。 SRB からの酸素欠乏と高濃度の硫化物はサンゴ組織にとって致命的であるため、BBD の病因において最も重要な要因と考えられています 15,22。いくつかの研究では、シアノバクテリアの毒素も病変前部でのサンゴ組織の壊死に関係しているとされています23。一方、BBDのSOBメンバーは今のところ不可解だ。一般的な SOB メンバー (Beggiatoa spp. および/または Rhodobacterales など) は、地理的に大きく異なる場所から得られた BBD 微生物コンソーシアムの非常に微量な構成要素に相当します 17、19、20、24、25、26、27、28。これは、SOB 活性自体が BBD 病因の主な要因ではなく、その欠乏が BBD 病変内での硫化物の蓄積を助長している可能性があることを示唆しています 15。それにもかかわらず、紅海での他の研究では、アルコバクター sp. (つまり、他の生存可能な SOB メンバー) は BBD 病変に非常に豊富でした 28。さらに、BBD は、冬の非活性な BBD や BBD の衰退期である秋と比較して、活発な夏には細菌の多様性が低く、同様の細菌組成パターンを示しています 29。シアノバクテリアパッチ（CP）状態として知られるBBD前駆体も、通常のBBD状態と比較して低い移動速度と高い細菌多様性を示しました20。 BBD 微生物コンソーシアムの複雑さとダイナミズムの両方により、BBD の病因とその発病と病原性の根底にあるメカニズムは、特に細菌の組成と局在との関連に関しては、依然として未解決のままです 15。さらに、BBD 病変内の微細スケールの微生物の局在は完全には解明されておらず、これにより BBD と多微生物の動態が解明される可能性があります 15。

BBD の病原性に関与する微生物コンソーシアムを特徴付けるために、細菌群集の組成と局所性が BBD 遊走速度 (病原性の代用) とどのように異なるかを調べました。この研究では、走査型電子顕微鏡 (SEM)、細菌群集配列決定、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション (FISH) と非脱灰サンゴ切片の組み合わせ法を使用して、BBD 病変内の多微生物コンソーシアムが移動速度によってどのように異なるかを特に調べました。地域的な変動を考慮して、BBD サンプルは沖縄県の 2 つの地理的場所から収集されました (補足図 1)。

沖縄県の瀬底島と阿嘉島（補足図1）では、異なる深さからの38個のBBD病変（コロニーごとに1個の病変、2014年はそれぞれn = 9、2015年はそれぞれn = 10）が0.30から0.30の範囲の直線移動率を示しました。 6.36 mm/日まで（補足図2a）。移動速度と深さの間に相関関係は見つかりませんでした (スピアマンの順位相関、⍴ = 0.21、p 値 = 0.21)。さらに、水温は場所と年の間で変動しましたが（補足図2b）、各場所と年ごとにプロファイルされた移動速度には差はありませんでした（一元配置分散分析、F = 0.95、p値 = 0.43）。 2014 年からの 18 個の BBD 病変すべてと、2015 年からの 20 個の BBD 病変のうちランダムに選択した 12 個を、それぞれ SEM 観察と 16 S 細菌プロファイリングと FISH の組み合わせの両方の下流解析に使用しました。

健康なサンゴ組織に隣接するBBDマット表面のSEM画像は、より細い糸状ラン藻（補足図3a）、比較的太い糸状ラン藻（補足図3b）、糸状微生物（補足図3c）を含む多数の微生物の存在を形態学的に示した。他の棒状細菌（補足図3d）、および2種類の繊毛虫（補足図3e-f）。阿嘉島のサンプルでは、細胞外高分子物質（EPS）の構造がシアノバクテリアの集合体の表面全体で観察されましたが、瀬底島の個々のシアノバクテリアのフィラメント全体ではEPSの構造は通常観察されませんでした（図2）。 EPS マトリックスの有無に関係なく、両方の場所の BBD マットで見つかった微生物は形態学的に類似していました。健康なサンゴ組織の境界から1 mm以内のBBDエリアでは、場所や移動速度に関係なく、より細い糸状ラン藻（補足図3a）がすべてのサンプルで一貫してマットを支配していました（図2）。より太い糸状ラン藻（補足図3b）は、阿嘉島からの移動速度が2.74 mm /日、瀬底島からの移動速度が4.18 mm /日のサンプルでのみ見つかりました。糸状微生物（補足図3c）は、1.89 mm /日から3.99 mm /日の移動速度で両方の場所のサンプルに出現しました。繊毛虫は、細長い管状の本体（タイプ A、補足図 3e）とペレット状の本体（タイプ B、補足図 3f）の 2 つの異なる形状を示しました。 A 型および B 型繊毛虫は、それぞれ 0.30 ～ 5.63 mm/日および 1.53 ～ 5.96 mm/日の範囲のさまざまな移動速度で、サンプル全体の表面で広く観察されました。

瀬底島のサンプル (a、パネル b の上部) は、阿嘉島よりも表面に不純物を含まないシアノバクテリアのフィラメントを示しています。阿嘉島では、サンプル (パネル b および c の下部) の表面に細胞外高分子物質 (EPS) が見られました。さまざまな移動速度における 2 つの場所間の表面の外観の比較 (b)。スケールバーは 200 μm (a および c) および 20 μm (b) を示します。 BBD の移行方向は右から左です (a および c)。

2.13 ～ 6.36 mm/日の範囲の異なる直線遊走速度を持つ 12 の別々の BBD バンド (個々のコロニーごとに 1 つのバンド) (図 3a) には、さまざまな細菌群集が含まれていました (図 3b)。細菌のアルファ多様性（観察されたOTUおよびChao1リッチネスインデックスによって明らかに）は、移動率と負の相関がありました（スピアマンの順位相関、⍴ = −0.80、p値<0.01、および⍴ = −0.74、p値<0.01）（図1）。 3c）。注意として、低い BBD 遊走 (2.34 mm/日) と高い多様性を示す組成データの 1 つのサンプル (SF_04) は、潜在的な外れ値 (z スコア = 3.04) として特定されました。外れ値がなければ、結果は依然として移動率との有意な負の相関を示しました (スピアマンの順位相関、観察された OTU については ⍴ = −0.76、p 値 < 0.01、Chao1 リッチネスインデックスについては ⍴ = −0.68、p 値 < 0.05)。移動との相関における組成データによるバイアスを回避するために、下流分析のためにデータに中心対数比（clr）変換を適用し、変換ベースの主成分分析で視覚化しました（tb-PCA;図3d））。サンプリングの場所と深さは、家族レベルでの clr 形質転換細菌群集の違いに有意な影響を与えませんでした (PERMANOVA、場所: R2 = 0.12、p 値 = 0.21、深さ: R2 = 0.06、p 値 = 0.76、および両方)位置と深さ: R2 = 0.07、p 値 = 0.75)。移動速度と clr 変換された細菌群集の存在量に基づく距離行列の間の相関関係を評価するために、マンテル検定が実行されましたが、有意な相関は示されませんでした (R: 0.06786、p 値: 0.297)。ただし、ファミリーレベルでの代表的な細菌と移動速度との間の偏相関パターンは、clr 変換行列によって検証されました。潜在的な SOB ファミリーである Rhodobacteraceae と Arcobacteraceae の 2 つだけが、線形移動率とそれぞれ負および正の有意な相関関係を示しました (スピアマンの順位相関、⍴ = –0.59、p 値 < 0.05、⍴ = 0.85、および p 値 < 0.01) (図) .4および補足表3)。すべてのサンプル中の 44 の OTU (操作分類単位) はロドバクテリウム科に属し (補足表 1)、OTU は 2 つだけ (OTU 6 と OTU24) で、それぞれ 0.01 ～ 13.47% と 0.01 ～ 6.96% の範囲でした。総和スケーリングで総相対存在量の 1% を超えていた (補足表 2)。 OTU 6 はルゲリア属に割り当てられ、カリブ海の BBD から取得された未培養アルファプロテオバクテリウム 128-64 (AF473938) の配列と正確に一致しました (補足表 2)。 OTU 24はタラソビアス属として特定され、紅海からのBBDマット中の未培養細菌クローンBBD-Aug08-3BB-36（GU472129）と未培養細菌クローンOtu0020（MH341656）の両方に100％類似していました（補足表2））。生存可能な硫化物酸化剤または従属栄養細菌 (詳細は議論を参照) として、Arcobacteraceae は、さまざまな移動速度にわたってすべての BBD サンプルで 14 個の OTU が見つかりました。そのうちの 3 つは OTU 8、OTU 9、および OTU11 であり、その範囲は 0.54 でした。 - 合計合計スケーリングで、それぞれ6つのサンプルで10.84％、9つのサンプルで0.03〜10.81％、すべてのサンプルで0.01〜5.46％（補足表2）。 Arcobacteraceae の 3 つの OTU はすべて、インド太平洋およびカリブ海の BBD で観察された細菌 (98.88 ～ 100% の類似性) と密接に関連していました (補足表 2)。 Arcobacteraceaeの14のOTUのうち6つ（代表的なOTU 9を含む）は、移動速度と正の相関がありました（補足図4a）。 OTU ショートリードの系統学的配置では、参照ツリー内の Arcobacteraceae 科全体で 14 個の OTU が互いに離れていましたが、一部の OTU は一緒にクラスター化されていました。たとえば、OTU 8 と OTU 1074 はクラスターにグループ化されます (補足図 4b)。 3つのOTU（OTU 27、OTU 192、およびOTU 952）はMalarcobacter属に属し、1つのOTU（OTU 144）はHalarcobacter属に属し、他のOTUは非培養グループに分類されました（補足図4b）。 Desertifilaceae に属するシアノバクテリアなどの他の科 (詳細は補足表 3 および補足注記 1 を参照) は有意な相関関係を示さなかったが、移動率とともに正に増加する傾向がありました (補足表 3)。

2 つの場所からの BBD のさまざまな移動速度に沿った (a)、上位 24 ファミリー、未分類の細菌およびその他 (相対存在量の平均 <0.5% がプールされた) の相対的な細菌存在量 (サイズで示される) を示すバブルプロット。合計スケーリング (b)。合計合計スケーリングでのスピアマンの順位相関によって計算された、BBD からの移動率とアルファ多様性 (OTU の豊富さと Chao1 インデックス) の間の有意な相関関係 (c)。灰色の陰影は、スピアマン順位相関の 95% 信頼区間を示します (c)。 BBD の細菌群集 (ファミリーレベル) を表す clr 変換ベースの主成分分析 (tb-PCA) (d)。サンプルID「AF」「SF」はそれぞれ阿嘉島と瀬底島で採取したものです。

各ファミリー (a: ロドバクテラ科、b: アルコバクテラ科) の clr 変換行列を OTU 全体で合計しました。有意な相関は * p < 0.05 および ** p < 0.01 としてマークされます。影付きの灰色の領域は 95% 信頼区間を表します。

特徴的な移動速度にわたる BBD 内の細菌の局在を研究するために、FISH を適用して、細菌群集分析で使用したのと同じ BBD サンプル内の細菌の分布を検査しました。 Arcobacteraceae 科に属する配列が移動速度とともに有意な増加を示したことを考慮して（図 4b）、プローブ Arc9430 を広範囲細菌プローブ EUB338mix31 とともに使用して Arcobacteraceae を標的にしました。 FISH を実行する前に、インシリコ分析を使用して、アルコバクテリウム科の 14 個の OTU をカバーできる新しく設計されたプローブを評価しました。 2つの代表的なOTU（OTU 8およびOTU 9）を含む14のOTUのうち10は、系統発生的配置分析に基づいて特定のプローブArc94に理想的に一致しました（補足図4b）。

サンゴの組織や骨格を含む無傷の細菌の分布とその局在性を視覚化するために、FISH32 を脱灰していないサンゴの切片作成と組み合わせた最近確立された方法を使用しました 33。 FISH プローブからの非特異的結合シグナルはサンゴ骨格領域で検出されましたが (補足図 5)、サンゴ組織内の細菌の局所と無傷の骨格構造を視覚化することに成功しました (補足図 6)。

多くの EUB338mix プローブ信号は、健康なサンゴ組織の境界から黒いバンドまでの微生物マット内の細菌の局在を示しました。一方、EUB338mix プローブシグナルは、健康な組織内では存在しないか、ほとんどありませんでした。細菌の局在は、シアノバクテリアが優勢なマット内で垂直に層状の構造を示し、シアノバクテリアが最上層を覆いましたが、多くのバクテリアはシアノバクテリア層の下の壊死したサンゴ組織と共生渦鞭毛藻の周囲に広がっていました（図5a）。連続切片では、特異的プローブ Arc94 を使用して、シアノバクテリア層の下の Arcobacteraceae の集合体および個々の細胞も観察されました (図 5b)。 EUB338mixシグナルからの細菌の集合体はさまざまな個々の形状を示しましたが（図5c）、アルコバクテリウム科の集合体はほぼ同じ細胞形態を示しました（桿状細菌、図5d）。さらに、Arcobacteraceaeの分布パターンは、それらがサンゴ壊死組織と密接に関連していることを示しました（図5d）。

自己蛍光を示す BBD の微生物マット構造の共焦点マージ顕微鏡写真 (青はサンゴ組織を示し、緑は共生渦鞭毛藻 [Sym] およびシアノバクテリアからのクロロフィルを示します) およびプローブ標識 Cy3 (赤) を有するハイブリダイズした細菌 (ad)。シアノバクテリアは、クロロフィルの自己蛍光と Cy3 による細菌シグナルの 2 つのチャネルをマージした黄色で示されています (a および c)。 a と b の点線は、拡大されたクローズアップ領域 (c と d) を示しています。 Arcobacteraceae のハイブリダイズしたシグナルは、それらの集合体と分散した細胞を示しています (b の点線と黄色の矢印)。スケールバーは 30 μm を表します。

細菌の局所性と移動速度の関係を調べるために、すべての細菌とアルコバクテリウム科の細菌の存在面積を微生物マットの上層、中層、下層（各垂直間隔1 mm、図6a）で空間的に定量化しました。移行率との比較。 SEM 観察と細菌群集分析により、優勢なシアノバクテリアが常に上層に存在することが示されたため、この定量分析では糸状シアノバクテリアの領域は除外されました (以下、「すべての細菌の領域」とは、細菌が分布している領域として定義されます)。シアノバクテリア）。標的細菌の分布を最適に比較できるように、連続切片上で EUB338mix および Arc94 プローブを使用して FISH を実行しました (図 6b、c)。 EUB338mix プローブで測定されたすべての細菌の検出領域は、特定の Arc94 プローブで測定された Arcobacteraceae の領域よりも大きかった (図 6d)。両方の FISH シグナルが、異なる移動速度にわたって 3 つの層すべてで検出されました（図 6e-j）。表層では、すべての細菌および Arcobacteraceae の検出は、移動速度との関係を示さなかった（図 6e、f）。中層でのみ、アルコバクテリウム科の面積が移動速度とともに増加しました（調整R二乗0.04およびp値<0.05）（図6g、h）。対照的に、すべての細菌の面積は移動速度と有意な正の関係を示しましたが、それは最下層のみでした（調整R二乗0.06およびp値<0.05）（図6I、g）。

空間解析用の BBD マットの 3 層 (表面、中間、底部、各垂直間隔は 1 mm) を示す概略図 (a)。共焦点マージ顕微鏡写真は、2 つの連続切片におけるすべての細菌 (b) および Arcobacteraceae (c) の細菌の空間的局在 (赤) を示しています。それぞれEUB338mixおよびArc94プローブとハイブリダイズしました。スケールバーは 50 μm (b および c) を示します。さまざまな移動速度におけるすべての細菌 (糸状ラン藻を除く) とアルコバクテリウム科検出の両方の全領域を示すボックスプロットと結合されたドットプロット (色で表示。サンプル ID 'AF' および 'SF' は阿嘉島と瀬底島からの収集を示します) 、それぞれ）（d）。箱ひげ図の中心線は中央値を表し、箱の限界はサンプルの 25 および 75%、棒で表される上位四分位と下位四分位はサンプルの 5 および 95% です (d)。表面 (e および f)、中央 (g および h)、および最下層 (I および j)。有意な相関は赤色で示され、* p 値 < 0.05 です。

この研究では、16 S 細菌プロファイリング、非脱灰切片、および FISH の新しい組み合わせを使用して、シアノバクテリアが優勢な微生物マットの移動（つまり、毒性の代理）が細菌の組成と空間的局在の両方に関連していることを実証することに成功しました。この研究における BBD 細菌群集は、帯状のバイオフィルムとして独特の移動パターンを示しましたが、移動速度が増加するにつれて多様性が薄れるグループで構成されていました。細菌群集分析では、Rhodobacteraceae 科および Arcobacteraceae 科の相対存在量が、BBD 遊走率とそれぞれ負および正の相関関係があることもわかりました。さらに、BBD の遊走速度が増加するにつれて、アルコバクテリウム科の個体数が中層で大幅に増加する一方、すべての非シアノバクテリアの個体数が下層で増加しました。

Arcobacteraceae は、最近、Epsilonproteobacteria 門の Arcobacter 属の新しい科 (Campylobacterales 目、Campylobacteria 綱、および Campylobacterota 門) として提唱されました 34。その後、6 つの名前付き属が提案され、元の Arcobacteraceae の Arcobacter 属から移動されました 35。しかし、最近、On らによって新たな提案がなされました。は、アルコバクター科の属を再び単一のアルコバクター属に再分類しました 36。私たちの結果は、Arcobacteraceae (= Arcobacter sensu lato34,35,36) が BBD の病原性に深く関与していることを示唆しています。 BBD におけるアルコバクターの存在は、カリブ海、インド太平洋、紅海の幅広い地理的地域で一般的に報告されています 28、29、37、38。 Arcobacteraceae は一般に、空気耐性があり、低温栄養性であり 36、環境や動物に遍在しています 39。 BBD マット 40 内の空間的 (特に垂直方向) および時間的不均一な酸素条件を考慮すると、アルコバクテリア科の個体群が低い移動速度から高い移動速度で BBD のすべての層に出現したという我々の発見は、BBD に関連するアルコバクテリア科が空気耐性であることを示唆しています。

海洋環境から分離された Arcobacteraceae のメンバーは、in vitro および in silico 分析を通じて、独立栄養性またはケモリトヘテロ栄養性の硫化物酸化剤として同定されています 41,42,43。以前のBBD研究では、「シアノバクテリアパッチ」(CP)と呼ばれるBBD前駆体からBBDへの発達移行中にロドバクテラ科の相対存在量が減少したが、これはより遅い速度で進行したが、アルコバクター属の相対存在量は減少した。 BBD が発達して毒性が高まるにつれて増加しました20。 BBDにおけるロドバクテラル目の寄与は、BBDにおける硫化物酸化の重要な機能遺伝子（soxB）を使用したプロファイリングによって確認されています。しかし、ロドバクテラル目に属する soxB 遺伝子の相対的な存在量は、CP17 と比較して BBD マットでより多く増加しました。アルコバクター由来の soxB 遺伝子は検出されませんでした。これはおそらく、soxB 遺伝子のユニバーサルプライマーがアルコバクター属 44 の配列を同定できないためと考えられます。実際、PCR バイアスのないショットガンメタゲノム配列決定研究では、BBD38 の SOB の主要メンバーとしてアルコバクターが報告されました。総合すると、アルコバクターがBBDコンソーシアムにおける硫黄サイクルの硫化物酸化段階で役割を果たしている可能性が高い。さらに、硫黄酸化を行うアルコバクターは、高硫化水素および低酸素レベルに対する耐性が高く、共生する他の SOB と効果的に競合するため 45、我々の結果は、BBD における硫化物酸化の機能的ニッチがロドバクテリア科からアルコバクター科に転移した可能性があることを示しています。 BBDの毒性が高くなったため。

FISH からの我々の結果は、特に BBD マットの中層における Arcobacteraceae の個体数が移動速度とわずかではあるが正の相関があることを示しました。硫化水素と酸素の垂直方向の化学分布は、日中（硫化水素が低く、酸素がマットの深さとともに垂直方向に減少する）から夜間（硫化水素が垂直方向に増加し、マットが完全に無酸素状態になる）までBBDマット内で動的に変化します40が、アルコバクターは可能性があります。あらゆる状態の中で調停し、その豊かさを維持します46。さらに、アルコバクターのメンバーの 1 つ (Candidatus A. sulfidicus) は、運動性の高い微好気性微生物として報告されており、これは有酸素性と無酸素性の界面に生息する典型的な生物であると思われます 45。サンプルを収集した日中のBBDの化学状態40を考慮すると、BBDマットの中間層は、アルコバクテリウム科の増殖を可能にし、硫化水素や酸素レベルを含む環境条件に適応し、同時に硫化物によってSRBに硫酸塩を提供する可能性があります。酸化を抑制し、BBD 毒性に関連する可能性のあるコンソーシアムの移動を促進または変化させる役割を果たします。さらに、全ゲノム予測によると、アルコバクター属も同化性硫酸還元に関与する遺伝子の完全なセットを持っていることを考えると 46、BBD マットにおける硫化物酸化だけでなく硫酸還元におけるアルコバクター科の役割を確認するには、今後の研究が必要である。

BBD の Arcobacteraceae は、サンゴ組織に直接損傷を与える病原体としても機能する可能性があります。アルコバクターは、世界中のサンゴ礁で、白痘47、ホワイト症候群48、ブラウンバンド病48、石サンゴ組織喪失病49など、BBD以外の多くのサンゴの病気の病巣からも大量に検出されています。 in vitro のヒトおよび動物の細胞培養アッセイでは、アルコバクター属がコロニー形成と宿主組織での感染の確立に関して顕著な毒性を持っていることが示されています 50,51。また、ほとんどのアルコバクター属が ciaB、irgA などの毒性遺伝子を備えていることも知られています。、およびcadF52、53。したがって、海洋生物における病原性アルコバクターの存在には、さらに焦点を絞った研究が必要です。

バイオフィルムは多くの臨床感染症に関与しており、蓄積された証拠は、バイオフィルムが病因、特に慢性感染 54 および口腔プラーク 55 に寄与していることを示しています。病原性バイオフィルムの中で、最もよく研究されているシステムには、ヒトの口腔プラークが含まれます。物理的除去によって多微生物バイオフィルムが部分的に除去された後、微生物の成熟した群集が再定住するまで、同様の一般的な時空間的遷移において定着サイクルが繰り返されます 56。移行中、初期の細菌の定着と組成は個人によって異なりますが、最も豊富な属は通常保存されています。細菌組成の突然または微妙な変化は、疾患に関連する表現型を促進するとよく考えられています57。ヒトの歯周炎における特定の複数の微生物の関連は、疾患の重症度と進行を悪化させる可能性があります57。 BBD では、アルファバクテリアの多様性は移動と負の相関があることが示されました。これまでの研究では、非活性なBBDとCP（シアノバクテリアパッチ）がそれぞれ高い細菌多様性と非遊走性および低い遊走率に関連していることが判明した20,29。 FISH の結果は、移動速度の増加とともに細菌数のわずかな増加を示し、BBD 細菌コンソーシアムが複雑であり、個々の BBD マット内で増殖する多様性が低い可能性があることを示唆している可能性があります。しかし、BBD の遊走速度の変動は、高い遊走速度で BBD に出現する特定の細菌群集と関連付けることはできませんでした。実際、サンゴの病原体として知られるいくつかの種を含むビブリオ科細菌科 58,59 は、移動勾配に関係なく出現しました（図 2b）。それにも関わらず、遊走率の高いBBDではロドバクテラ科が減少し、アルコバクテラ科が増加する傾向が確かに確認された。

FISH 実験では、BBD 微生物マット内の細菌はさまざまな移動速度の空間分布パターンを示しました。 Arcobacteraceae の集団に加えて、最下層のすべての細菌集団は BBD 移動速度と弱い正の相関を示しました。細菌群集の結果と組み合わせると、我々の微生物の可視化は、高いBBD毒性に関連する細菌群集構造が、特に最下層で他の細菌を排除する強力な選択の下で繁栄することを示唆しました。 BBD の最下層では、日中でも低酸素または無酸素状態が予想されます 15 が、SRB と嫌気性従属栄養生物の両方にニッチが提供される可能性があります。

この研究は、細菌組成/空間的局在の変化とBBD、特にモンティポーラサンゴのBBDの移動速度との間の相関関係を初めて実証した。つまり、この研究はBBDの微生物の動態について新たな洞察を提供し、BBDにおける微生物媒介の病因モデルがこれまで考えられていたよりも複雑であることを示している。しかし、我々の結果は、Arcobacteraceae が毒性 BBD の細菌群集構造における重要な基盤の 1 つである可能性があることを示しています。 Arcobacteraceae と BBD 毒性の間に正の相関があることを考慮すると、我々は Arcobacteraceae が BBD 毒性の潜在的なバイオマーカーであると提案します。多くの種が BBD の影響を受けることが知られているため、これらの発見は他の多様なサンゴ分類群でテストされる必要があります。さらに、我々は、細菌群集と非脱灰切片技術を組み合わせた細菌群集とFISHの新たに開発した組み合わせを使用して、サンゴ疾患の病原性とともに細菌組成/無傷の空間的局在を明らかにすることで、他のサンゴ疾患についてのさらなる研究を奨励します。

この調査は、沖縄県の瀬底島（北緯26度38分35.2秒、東経127度51分49.5秒）と阿嘉島（北緯26度12分00.0秒、東経127度16分45.0秒）付近の2つのサンゴ礁で実施されました。日本（補足図1）。両サイトは互いに約 70 km 離れており、その間には外洋があります。 2014 年の夏 (各場所で n = 9) と 2015 年の夏 (各場所で n = 10) に、合計 38 個の BBD に感染した外皮をまとったモンティポラコロニーの直線移動速度が測定されました。それぞれの個々のコロニーにおける BBD の直線移動速度を決定するために、サンプリングの 3 日前とサンプリング当日の両方で、コロニーの平らな領域の BBD 病変の正面の写真を撮影しました。以下のモデルの変数としての BBD の平均直線移動速度 (mm/日) は、Fiji ソフトウェア 60 を使用して、各コロニーの領域上の 5 つのランダムな点で計算されました。また、観察中に Onset HOBO ペンダントロガー® を使用して、BBD に感染した各コロニーの深さを測定し、水温を (1 時間間隔で) 記録しました。移動速度と深さの間の相関関係を評価するために、統計ソフトウェア R v4.0.261 を使用して Spearman の順位相関を実行しました。場所および年にわたる移住率の分散の比較は、統計ソフトウェア R v4.0.261 を使用した一元配置分散分析 (一元配置 ANOVA) によっても検証されました。

下流分析では、2014 年には 18 コロニーすべてから、2015 年には 20 コロニーのうち 12 コロニーからサンプル (各場所から n = 6) が走査型電子顕微鏡 (SEM) 観察および細菌群集と FISH の組み合わせ分析のためにそれぞれ採取されました。健康な組織と骨格を含む BBD 領域（長さと幅は約 3 ～ 4 cm、深さは 1 cm）の各サンプル（個々のコロニーごとに 1 つのサンプル）を、直線移動が行われている領域でハンマーとノミを使用して切断しました。率が測定されました。 SEM 用に、サンプルを約 1 cm 四方にトリミングし、氷上の 10 mM リン酸緩衝食塩水 (PBS、pH 7.4) 中の 2% グルタルアルデヒド (GA) によって直ちに固定し、引き続き 4 °C で保存しました。細菌群集分析および FISH 組み合わせ分析では、サンプルをそれぞれ約 2 cm 四方の 2 つの部分に切断しました。 1 つの標本を滅菌革パンチ (円直径 4 mm) で黒いバンドから打ち抜き、細菌群集分析のためにバンドを 300 μl の 100% エタノール中に -80 °C で保存しました。 2 番目の標本 (約 2 cm 四方) をすぐに、4% パラホルムアルデヒド (PFA) を含む PBS (和光、日本) 中で 4 °C で 8 時間固定し、70% エタノールで 3 回リンスし、70% エタノールで 250℃ で保存しました。以下の FISH の場合は 4 °C。

GA 固定サンプル (n = 18) を PBS で 15 分間 3 回穏やかにリンスし、エタノール/水勾配シリーズ (20、40、60、70、90、および 100% を 1 回、無水エタノールで 1 回) で脱水しました。 3回）室温で各20分間。脱水した GA 固定サンプルを abs に浸漬しました。エタノール/t-ブチルアルコールの段階的シリーズ (7:3 および 1:1、各 15 分間)、25.5 °C 以上で 60 分間 t-ブチルアルコールに移し、古い t-ブチルアルコールと交換した後冷蔵庫に保管新しいお酒と一緒に。凍結乾燥装置 (VFD-21S、真空 VD、日本) を使用してサンプルを 3 時間乾燥し、イオンスパッタ (E-1010、日立、日本) で白金/パラジウム合金でコーティングしました。観察と画像取得は走査型電子顕微鏡 (SEMS-3500N、日立、日本) によって行われました。健全なサンゴ組織との境界からBBDマットまでの表層1mm以内の範囲の微生物を観察し、ランダムに撮影して微生物の有無を判定した。合計 42 枚の画像 (倍率 100 倍で 6 枚、倍率 1000 倍で 18 枚、および 2000 倍で 18 枚) を各 BBD 病変から撮影しました。

300 μl の 100% エタノール中の BBD でパンチしたサンプル (n = 12) に、120 μl のヌクレオチドを含まない水と 12 μl の 3 M 酢酸ナトリウムを直接加え、ボルテックスで混合し、-20 °C で 45 分間保存しました。分。 18,000×gで20分間遠心分離した後、ペレットを300μlの予め冷却した70%エタノールに再懸濁し、上記と同じ条件で再度遠心分離し、溶液から取り出し、乾燥させた。ゲノム DNA を DNeasy Blood & Tissue キット (Qiagen) によってペレットから抽出しました。これには、リゾチームベースの酵素溶解ステップ (緩衝液: 20 mg/ml リゾチーム、20 mM Tris-HCl [pH 8.0]、2 mM) の追加が含まれていました。 EDTA [pH 8.0]、および 1.2% Triton X-100)、メーカーのプロトコルに従って。

ゲノム DNA を、ユニバーサルプライマーセット (515 F および 806 R、補足表 4) および次の PCR 手順を使用した細菌 16 S rRNA 遺伝子の V4 領域の増幅のためのテンプレートとして使用しました: 95°で 30 秒の 35 サイクルC（変性）、51 °Cで30秒（アニーリング）、72 °Cで30秒（伸長）、その後72 °Cで5分間さらに伸長しました。次に、Nextera XTインデックスキット（Illumina、米国）を使用してPCRによってインデックス配列を追加しました。アンプリコンは、MiSeq シーケンサー (Illumina、米国) によるペアエンドリードケミストリーによる配列決定のために送られました。シーケンスリードは補足表 5 にまとめられています。

各サンプルからのペアエンドリードは、MacQIIME v.1.9162 を使用してソフトウェア QiimeI でマージされました。得られたマージされた配列は、以下の基準を使用してソフトウェア MOTHUR v.1.39.563 でフィルタリングされました：（1）249 ～ 256 bp のリード長。 (2) 読み取り品質スコア平均 27。 (3) ホモポリマーのリード長 < 8 bp。さらに、USEARCH アルゴリズム v.11.0.66764 を使用してキメラ配列を検出し、その後キメラ配列を除外しました。クラスター OTU に対して 97% の類似性カットオフを使用して USEARCH を実装しました。 OTU は、カットオフ値 80 の MOTHUR を使用して Silva SSU r138.1 データベース 65 にマッピングすることにより、既知の分類群に割り当てられました。真核生物、古細菌、未知および葉緑体から配列を除去した後、合計 1,593 個の細菌 OTU が割り当てられました。 255 ファミリー (1401 OTU)、未分類細菌 (151 OTU)、未培養細菌 (10 注文の 31 OTU)、未培養ファミリー (3 クラスの 4 OTU)、および未知のファミリー (2 注文の 6 OTU) まで。

細菌群集データセットの統計分析は、R パッケージ phyloseq v.1.34.066 および vegan v. 2.5-767 を組み込んだ統計ソフトウェア R v4.0.261 を使用して実行されました。アルファ多様性指数 (OTU リッチネスと Chao1) は、phyloseq 内の関数「estimate_richness」を使用して計算され、移動速度に沿った相関関係は、統計ソフトウェア R v4.0.261 のスピアマンの順位相関を使用しました。ベータ多様性分析では、家族レベルの phyloseq データが、R パッケージマイクロバイオーム v. 1.12.068 の Centered Log Ratio (clr) 変換関数を使用して変換され、関数「距離」を使用してユークリッド距離を使用して距離行列が計算されました。 R パッケージ phyloseq。変換ベースの主成分分析 (tb-PCA) は、R パッケージ phyloseq の関数「縦座標」を使用して視覚化されました。組成データに対する位置とサンプリング深さの違いの影響を評価するために、R パッケージ vegan の関数「adonis2」を使用して、順列多変量分散分析 (PERMANOVA) テストを実行しました。遊走速度の違いと菌群集構成の違いとの相関関係を評価するために、統計ソフトRの関数distを用いて遊走速度をユークリッド距離による距離行列に変換し、マンテルテストを適用した。 clr 変換された細菌構造の距離行列と R パッケージ vegan の移動距離行列 (スピアマンの順位相関と 999 の順列)。続いて、各代表細菌ファミリーの clr 変換行列を使用して偏相関分析を決定し、統計ソフトウェア R のスピアマンの順位相関検定を使用して計算された BBD 線形移動率を計算しました。

さらに、代表的な OTU (合計合計スケーリングで > 1% を示す) をヌクレオチド-ヌクレオチド BLAST 検索にかけて、GenBank データベース (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi）。最も近い配列は、blastn (ヌクレオチドコレクション nr/nt) および機能「Blast Tree View (ツリー法: Fast Minimum Evolution および Max Seq Differences: 0.75)」の高い類似性と系統位置によって選択されました。結果が複数の配列にヒットした場合、BBD、サンゴの病気、健康なサンゴに関連する情報源からのものを選択しました。

偏相関分析によると、Arcobacteraceae 科には、BBD 遊走と正の相関がある 14 個の OTU が含まれていました。したがって、14のOTUのプローブ特異性を推定した後、特定のプローブ、ほとんどの細菌にはEUB338mix31,69、アルコバクテリウム科にはArc9430（補足表4）を使用し、非脱灰薄切片法でFISHを実行しました。

アルコバクター科由来の 14 個の OTU のプローブ特異性を推定するために、アルコバクター属、マラシオバクター属、ハラルコバクター属、シューダルコバクター属、ポセイドニバクター属および未培養のアルコバクター属からなるアルコバクター科に割り当てられた 653 の参照配列を Silva SSU r138 データベースから取得しました 65。 TestProbe 3.0 (https://www.arb-silva.de/search/testprobe/) を使用して、参照配列が Arcobacter 用の Arc94 プローブ 30 と一致するかどうかもテストされ、プローブは Arcobacteraceae のカバー率を 78.0% (509 個) と推定しました。 653 の参照配列のうち）。参照ツリーの構築では、ソフトウェア infernal v.1.1.370 を使用して参照配列をアライメントし、モデル GTR + G および 200 ブートストラップ複製を使用して最尤ツリーを RAxML-NG v.1.0.271 で構築しました。次に、プログラム PaPaRa コア v.2.572 を使用して 14 個の OTU 配列を参照多重配列アラインメントにアラインメントし、その後ソフトウェア EPA-ng v.0.3.673 によって参照ツリー上の最高推定スコア (like_weight_ratio) に配置しました。プローブの特異性を評価するために、インタラクティブな Tree of Life (iTOL) v.474 を使用してツリーを視覚化しました。 OTU 配列の系統学的配置は、参照ツリー上の EPA-ng によって推定され、アルゴリズムが参照ツリー上の複数の位置を計算する場合、「like_weight_ratio」の高いスコアで定義されました (スコアは 0.15 ～ 0.99 の範囲で定義されます)。。

70% エタノール中の PFA 固定サンプルを、10% スクロースを含む PBS に 4 °C で 1 時間入れ、20% スクロースに 4 °C で一晩移しました。次に、PFA 固定サンプルを包埋コンパウンド (SCEM、SECTION LAB Co. Ltd、日本) に包埋し、完全に凍結するまでドライアイスとヘキサンの混合物に浸漬しました。粘着フィルム 33 に貼り付けられた非脱灰セクショニングを実行し、クライオスタットを使用して炭化タングステンブレード (SL-T30、SECTION LAB Co. Ltd.、日本) を使用して厚さ 5 μm のサンゴ標本の PFA 固定サンプルから 3 つの連続切片を取得しました。システム（ライカ CM1850、ドイツ）。粘着フィルムに貼り付けた未脱灰切片を１００％エタノールに３０秒間浸漬して化合物を除去し、風乾した。 FISH は、Wada et al.32 に記載されているように、非脱蝋ステップおよび HCl 溶液への非浸漬ステップを含むわずかな修正を加えて実行されました。言い換えれば、風乾した切片を 20 mM Tris-HCl 溶液 (pH 8.0) で室温で 10 分間洗浄し、20 mM Tris-HCl 溶液を含むプロテイナーゼ K (50 μg/ml) にマウントしました。 37℃で5分間、ハイブリダイゼーション前に20mM Tris-HCl溶液ですすいだ。各連続セクションでは、Cy3 蛍光色素で標識された 3 つのプローブ：（1）EUB338mix31,69、（2）Non33875 を含むハイブリダイゼーションバッファー（0.9 M NaCl、20 mM Tris-HCl、および 0.01% SDS）でプローブハイブリダイゼーションを実施しました。 30% ホルムアミド、および (3) その 20% ホルムアミド (補足表 4)、46 °C で 1.5 時間の Arc9430。ハイブリダイズした各切片を洗浄緩衝液（20 mM Tris-HCl、0.01% SDS、5 mM EDTA（pH 8.0）、およびNaCl（EUB338mixおよびNon338プローブ処理の場合は0.112 M、Arc94プローブ処理の場合は0.225 M））中で48°で洗浄しました。 ℃で10分間。粘着フィルムに付着した洗浄切片を冷水で洗浄し、風乾し、スライドガラス（S2441、マツナミ）上に収集し、その後、退色防止溶液（Fluoromount/Plus、Diagnostic BioSystems）中でカバースリップをスライド上にマウントした。。

画像取得は、共焦点顕微鏡 (TCS SP8、Leica) で倍率 40 倍の対物レンズ (HC PL APO 40x/1.30 OIL CS2) を使用して実行されました。 Cy3 蛍光色素とクロロフィル (シンビオジニア科およびシアノバクテリア用) は 552 nm (2.0%) で励起され、HyD (標準モードおよびゲイン 100) では 571 ～ 582 nm、PMT (ゲイン 700) では 650 ～ 696 nm の発光範囲で検出されました。）。サンゴの自己蛍光も 405 nm (1.5%) で励起され、HyD (標準モードおよびゲイン 161) を使用して 460 ～ 510 nm の発光範囲で検出されました。細菌の存在領域を定量的に分析するために、BBD 断面の上層、中層、下層の 3 つの領域（各垂直間隔 1 mm）から 6 枚の画像（各サイズ 1024 × 1024 ピクセル）を取得しました。、図6a)。各プローブ (EUB338mix および Arc94) によって結合される蛍光シグナルは、Wada et al.32 によって詳細に説明されている基準に従って、特異的シグナルまたは非特異的プローブ結合 (Non338 プローブを使用) のいずれで識別されました。

ソフトウェアLAS X（Leica）を使用してCy3蛍光色素とクロロフィルの画像を8ビットグレースケールTIFF画像にエクスポートした後、ソフトウェアFiji60を使用して画像処理を実行しました。各グレースケール画像は、アルゴリズム「最大エントロピー」76 を使用した閾値関数によってバイナリ画像に変換されました。 EUB338mix プローブの Cy3 シグナル内のシアノバクテリア以外の細菌の存在を分析するために、クロロフィルシグナル内のシアノバクテリアの領域が機能「subtract」と手動キュレーションによって EUB338mix シグナルのバイナリ画像から差し引かれました。バイナリイメージは、「外れ値の削除」機能 (半径 1.5 およびしきい値 50) によってノイズを低減するためにフィルター処理されました。さらに、Cy3蛍光色素チャネルからのシグナルには骨格領域からの非特異的蛍光も含まれていたため（補足図5）、骨格領域からの蛍光はバイナリ画像から手動で除去されました。バイナリ画像に基づいて、シアノバクテリアとアルコバクテリア科を除く細菌全体の面積がピクセル単位で計算されました (バイオマスの観点からのそれらの集団サイズを反映しています)。 3 つの層の各領域と BBD の線形移動速度の関係は、統計ソフトウェア R v4.0.261 の線形回帰モデル (関数「lm」) を使用して測定されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究で生成されたすべての配列データは、アクセッション番号 DRA010783 で DDBJ Read Archive に提出されました。

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この研究は、JSPS 特別研究員のための科学研究費補助金 DC1 26•6085 および中央研究院からの資金提供によって支援されました。 NWは、共焦点顕微鏡イメージングにおける技術的支援とNWの博士号取得への意欲を励ましてくれた大久保賢明博士、川端坂田幸香博士、故中曽根清氏に感謝します。 NW はまた、彼に研究の機会を与えてくれた亡き父と母の両方に感謝しています。 NWは、彼らの旅が天国でうまくいくことを心から願っています。

この作品は、センリン・タン氏、真野信宏氏の共同監修によるものです。

生物多様性研究センター、中央研究院、No.128、Sec 2、Academia Rd、Nangang、Taipei、11529、台湾

和田直久 & センリン・タン

日本大学生物資源科学部海洋資源学科〒252-0813 神奈川県藤沢市

Naohisa Wada, Yuta Urabe, Natsumi Abe, Kazuki Takase, Shuji Hayashi, Saeko Kawanabe & Nobuhiro Mano

国立研究開発法人産業技術総合研究所地質調査総合センター〒305-8567 茨城県つくば市東1-1-1

Akira Iguchi

〒305-8567 つくば市産業技術総合研究所環境調和技術研究チーム [E-code]

Akira Iguchi

〒905-2192 沖縄県名護市辺野古905 沖縄工業高等専門学校生物資源工学科

Yuki Yoshioka

ジェームスクック大学理工学部、タウンズビル、クイーンズランド州、4811、オーストラリア

Yui Sato

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NW と NM がこの研究を発案しました。 NW、YU、NA、KT、SH、SKは、BBD移行率の測定を含むフィールドサンプリングを実施した。 SEM観察はNWとYUが行いました。 NW、AI、YY は配列データの分子処理、バイオインフォマティクスおよび統計解析を実施しました。 NWは組織学的研究、FISH観察、統計分析を実施した。 NW と S.-LT は原稿執筆と図作成に大きく貢献しました。 AI、YS、NM が原稿の執筆と編集に協力してくれました。 S.-LT と NM はこの原稿の共同連絡著者です。すべての著者が批判的にレビューしました。

センリン・タンまたは真野信宏との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

和田直也、井口暁、卜部裕也他微生物マットの組成と局在パターンは、サンゴにおけるブラックバンド病の毒性を説明します。 npj バイオフィルムマイクロバイオーム 9、15 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41522-023-00381-9

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受信日: 2022 年 10 月 6 日

受理日: 2023 年 3 月 13 日

公開日: 2023 年 4 月 4 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00381-9

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