哺乳類の嗅覚受容体によるアミン臭気物質知覚の構造基盤

Nature volume 618、pages 193–200 (2023)この記事を引用

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臭気物質は、哺乳動物の鼻上皮において、臭気物質受容体と微量アミン関連受容体 1、2 (TAAR) という 2 つの G タンパク質共役受容体ファミリーによって匂いとして検出されます。 TAAR は、有顎魚と無顎魚の分岐後に出現し、揮発性アミン臭気物質を認識して、誘引や嫌悪などの種内および種間の両方の生来の行動を誘発する受容体の大規模な単系統ファミリーで構成されています。今回我々は、マウスTAAR9（mTAAR9）と、β-フェニルエチルアミン、N,N-ジメチルシクロヘキシルアミン、またはスペルミジンと複合体を形成したmTAAR9-GsまたはmTAAR9-Golf三量体の低温電子顕微鏡構造を報告する。 mTAAR9 構造には、アミン臭気物質の認識に不可欠な、保存された D3.32W6.48Y7.43 モチーフで装飾された深くて緊密なリガンド結合ポケットが含まれています。 mTAAR9 構造では、N 末端を ECL2 に接続する独特のジスルフィド結合が、アゴニスト誘導性の受容体活性化に必要とされます。私たちは、モノアミンとポリアミンを検出するための TAAR ファミリーメンバーの重要な構造モチーフと、同じ臭気化学物質の認識に関与する異なる TAAR メンバーの共有配列を特定します。我々は、構造特性解析と変異解析により、Gs および Golf と結合する mTAAR9 の分子基盤を解明します。まとめると、我々の結果は、臭気物質の検出、受容体の活性化、およびアミン嗅覚受容体のゴルフカップリングに対する構造的基礎を提供する。

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この研究で作成または分析されたすべてのデータは、本文または補足資料に含まれています。クライオ EM 密度マップと原子座標は、アクセッションコード EMD-35762 (SPE-mTAAR9-Gs 複合体)、EMD-35763 (PEA-mTAAR9-Gs 複合体)、EMD-35705 (DMCHA) で電子顕微鏡データバンクに寄託されています。 -mTAAR9-Gs 複合体）、EMD-35764（CAD-mTAAR9-Gs 複合体）、EMD-35761（PEA-mTAAR9-Golf 複合体）、EMD-35765（SPE-mTAAR9 複合体のローカル改良）および EMD-35771（ローカルPEA-mTAAR9-Gs 複合体における PEA-mTAAR9 の改良）、およびアクセッションコード 8IW4（SPE-mTAAR9-Gs 複合体）、8IW7（PEA-mTAAR9-Gs 複合体）、8ITF（DMCHA-mTAAR9-Gs 複合体）に基づくタンパク質データバンク)、8IW9 (CAD-mTAAR9-Gs 複合体)、8IW1 (PEA-mTAAR9-Golf 複合体)、8IWE (SPE-mTAAR9 複合体のローカルリファインメント)、および 8IWM (PEA-mTAAR9-Gs 複合体における PEA-mTAAR9 のローカルリファインメント) ）。他のすべてのデータは、対応する著者からのリクエストに応じて入手できます。

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この研究は、中国の国家重点研究開発プログラム（2022YFC2702600からFY、2018YFC1003600からXYおよびJ.-PS、2019YFA0904200からJ.-PS、2021ZD0203100からQ. Liおよび2022YFA1104003からYX）、国家科学基金（優秀な若手学者）によって支援されました。 rs助成金 (J.-PS へ 81825022)、優秀な若手学者のための国家科学基金 (FY へ 82122070 および QL へ 32122038)、中国国立自然科学財団 (J.-PS へ 81773704 および XY へ 92057121)、主要研究プロジェクト中国北京自然科学財団の主要基礎研究プログラム（Z200019からJ.-PS）、中国山東省自然科学財団の主要基礎研究プログラム（ZR2021ZD18からXYおよびZR2020MH132からS. Liu）、科学および科学からの基礎研究プロジェクト上海市技術委員会（21JC1404500からQL）、山東省重点研究開発プロジェクト（2021CXGC011105からYX）、および上海教育開発財団と上海市教育委員会が支援する曙光プログラム（21SG16からQL）。分子シミュレーションは、山東大学の HPC クラウドプラットフォームで実行されました。データ収集については、Y. ying と W. Shui に感謝します。 SDL は、ハワードヒューズ医学研究所の研究者です。

これらの著者は同様に貢献しました: Lulu Guo、Jie Cheng、Shuo Lian、Qun Liu、Yan Lu、Yuan Zheng、Kongkai Zhu

中国済南市、山東大学Cheeloo医科大学、美麗湖トランスレーショナルリサーチパーク先端医療研究所

Lulu Guo、Jie Cheng、Kongkai Zhu、Xiang Han、Shangming Liu、Fan Yang、Jin-Peng Sun

中国済南市、山東大学医学部生化学および分子生物学科

Lulu Guo、Qun Liu、Yan Lu、Chao Zhang、Nakang Rong、Yuming Zhuang、Guoxing Fang、Jingjing Jiang、Tianyao Zhang、Xiang Han、Zili Liu、Fan Yang、Jin-Peng Sun

教育省の実験奇形学および山東大学基礎医学部生理学教室（中国済南市）の主要研究室

ジエ・チェン＆シャオ・ユー

北京大学基礎医学院生理学・病態生理学教室、教育省分子心血管科学重点実験室、北京、中国

Jie Cheng、Yuan Zheng、Jin-Peng Sun

中国済南市、山東大学斉魯病院一般外科

Shuo Lian、Minghui Zhang、Yunfei Xu

中国、上海の上海交通大学医学部松江研究所および松江病院

ヤレイ・コンとチェン・リー

上海交通大学医学部脳科学センター上海小児医療センター（中国、上海）

ヤレイ・コンとチェン・リー

教育省解剖生理学局 - 中国、上海の上海交通大学医学部新華病院小児環境衛生重点研究室

ヤレイ・コンとチェン・リー

中国山東省、山東第一医科大学付属山東省病院耳鼻咽喉科

ミン・シア

MOE 非平衡合成と凝縮物質変調重点研究室、西安交通大学物理学部、西安、中国

張雷

ハワード・ヒューズ医学研究所、ハーバード大学医学部細胞生物学科、ボストン、マサチューセッツ州、米国

スティーブン・D・リベレス

上海脳科学および脳にインスピレーションを受けたインテリジェンス研究センター、中国、上海

銭李

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J.-PS と Q. Li は TAAR 嗅覚受容体の研究を開始しました。 J.-PS、YX、FY がプロジェクトを主催しました。 J.-PS、XY、FY は全体的な実験計画と実行を設計および監督しました。 J.-PS、YX、FY、LG、JC がデータ分析と解釈に参加しました。 J.-PSとFYはすべての構造解析を指導しました。 Q. Li と SDL はオリジナルおよび改変された TAAR プラスミドを提供し、J.-PS、XY、FYLG とともに機能実験を組織し、Q. Liu は構造研究のための受容体スクリーニングを設計および実行しました。 YK、LG、Q. Liu、および Q. Li は、mTAAR9 昆虫細胞発現コンストラクトを生成しました。 LG、Y. Zheng、および YX は、PEA-mTAAR-Gs-scFv16、SPE-mTAAR-Gs-scFv16、および PEA-mTAAR9-Golf-scFv16 複合体の精製プロトコルを確立し、クライオ EM 用のサンプルを調製しました。 JC、S. Lian、および YL は、細胞ベースの G タンパク質活性アッセイ用に mTAAR9 構築物および変異体を生成しました。 JC、S. Lian、XH、S. Liu、および YL は、リガンド結合ポケットおよび G タンパク質相互作用変異体を設計しました。 JC、S. Lian、XY、YL は、Golf-Gβγ 解離アッセイを確立しました。 YL は質量分析アッセイを実施しました。 KZ は、対応する報告されている臭気物質受容体 Olfr2 および Olfr78 のリガンドポケット内にオクタナールとプロピオン酸の結合様式を構築しました。 KKZ と MZ は、mTAAR9 複合体構造内のリガンドの分子動力学シミュレーションを実行しました。 CZ は、apo-mTAAR9 モデルおよび PEA-mTAAR9-Gαsβ1γ13 モデルの分子動力学シミュレーションを実行しました。 LG、MZ、NR、JJ、Q. Liu、TZ、GF、Y. Zhuang、LZ、Y. Zheng はクライオ EM グリッドを準備し、SPE-mTAAR9-Gs-scFv16、PEA- のクライオ EM データを収集しました。 mTAAR9 – Gs – scFv16、PEA – mTAAR9 – Golf – scFv16、DMCHA – mTAAR9 – Gs – scFv16、および CAD – mTAAR9 – Gs – scFv16 複合体。 J.-PS が最初の原稿を書きました。 FY、Q. Li、LG、MX、XY は重要な議論と本質的な修正を提供しました。 Y. Zheng と JC が図 1a ～ c を提供しました。ＦＹ、ＬＧ、ＹＬ、ＭＸおよびＹＸは図を提供する。 1～5。 FY、JC、LG、S. Lian、および MZ は拡張データ数値を提供しました。

Yunfei Xu、Fan Yang、Qian Li、または Jin-Peng Sun との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。査読レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a、Bac-to-Bac® (Invitrogen) バキュロウイルス発現システムを使用して Sf9 細胞株で過剰発現された 6 個の hTAAR、13 個の mTAAR、および 16 個の rTAAR を含む、原形質膜画分中の TAAR 受容体のタンパク質レベル。データは、3 回の独立した実験からの平均 ± SEM として表されます (n = 3)。 TAAR を含むほとんどの嗅覚受容体は、バキュロウイルス昆虫細胞または哺乳動物 HEK293 細胞のいずれかにおける異種発現系を使用すると、発現レベルが非常に低いことがよく知られています。したがって、我々は原形質膜画分中の 35 種類の TAAR メンバーのタンパク質レベルをスクリーニングしました。ヒト (hTAAR) で 6 件、マウス (mTAAR8b および mTAAR8c を除く mTAAR) で 13 件、ラット (rTAAR、rTAAR8a を除く) で 16 件を含み、Spodoptera fragiperda (Sf9) 昆虫細胞と Bac-to-Bac® (Invitrogen) バキュロウイルスシステムを使用。注目すべきことに、mTAAR1、mTAAR9、rTAAR7d、hTAAR5、およびhTAAR6のみが原形質膜上で検出され、収量は約0.11～0.21 mg/Lの範囲でした。 f、Superose 6 Increase 10/300 GLを使用した精製mTAAR9-Golf、mTAAR1-Golf、rTAAR7d-Golf、hTAAR6-Golf、およびhTAAR5-Golf複合体の代表的なサイズ排除クロマトグラフィー溶出プロファイル。サイズ排除クロマトグラフィーにより、mTAAR9 のみがゴルフ三量体 (Gβ1-Gγ2) と均質で安定した複合体を生成するのに対し、他の 4 つの TAAR-Gαolf-Gβ1-Gγ2 複合体および Gαolf-Gβ1-Gγ13 と複合体を形成した TAAR はすべて不安定であり、定常状態になることが多いことが示されました。解離。サイズ排除クロマトグラフィーのピークは三角形でマークされています。 g、Superose 6 Increase 10/300 GLを使用した精製mTAAR9-G、mTAAR1-G、rTAAR7d-G、hTAAR6-G、およびhTAAR5-Gs複合体の代表的なサイズ排除クロマトグラフィー溶出プロファイル。サイズ排除クロマトグラフィーにより、mTAAR9 と mTAAR1 のみが Gs 三量体 (Gβ1-Gγ2) と均質で安定した複合体を生成するのに対し、他の 3 つの TAAR-Gs 複合体はすべて不安定であり、しばしば一定の解離を起こすことが示されました。サイズ排除クロマトグラフィーのピークは三角形でマークされています。

ａ、ｍＴＡＡＲ９を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞における、異なるアゴニストによる刺激に応答したＧα（Ｇｏｌｆ、Ｇｓ、Ｇｉ１〜３、Ｇｏ、およびＧｑを含む）−Ｇβγ解離の効力および有効性。ヒートマップは、pEC50 と Emax の値に応じて色付けされます。 ND、信号が検出できません。値は、mTAAR9 についての 3 回の独立した実験から平均したものです (n = 3)。略語: SPE、スペルミジン。 T1AM、3-ヨードチロナミン; DMCHA、N,N-ジメチルシクロヘキシルアミン; IAA、イソアミルアミン; IBA、イソブチルアミン; TMA、トリメチルアミン; CHA、シクロヘキシルアミン。 1-MPD、1-メチルピペリジン; PEA、β-フェニルエチルアミン; CAD、カダベリン。 PTC、プトレシン。 b、さまざまな臭気物質アゴニスト（SPE、SEP-363856、T1AM、DMCHA、 IAA、IBA、TMA、CHA、1-MPD、PEA、CAD、および PTC)。値は、3 回の独立した実験の平均 ± SEM として表されます (n = 3)。

ａ～ｄ、ＳＰＥ（ａ）、ＤＭＣＨＡ（ｂ）、ＰＥＡ（ｃ）、およびＣＡＤ（ｄ）の用量反応曲線は、ｍＴＡＡＲ９またはＢＲＩＬ－ｍＴＡＡＲ９過剰発現細胞においてＧαｓ－Ｇβγ解離を誘導した。値は、3 回の独立した実験の平均 ± SEM として表されます (n = 3)。受容体の発現を増加させるために、熱安定化シトクロム b562RIL (BRIL) が全長 mTAAR9 の N 末端に組み込まれ、このキメラタンパク質が野生型 mTAAR9 と同様の G タンパク質結合活性を示すことが判明しました。えー、SPE (e)、DMCHA (f)、PEA (g)、および CAD (h) の用量反応曲線は、mTAAR9 過剰発現細胞において Gαs-Gβγ または修飾 Gαs (modGαs)-Gβγ 解離を誘導しました。値は、3 回の独立した実験の平均 ± SEM として表されます (n = 3)。改変型 Gαs キメラ (modGαs) は、scFv16 の結合と置換を促進するために、Gs の N 末端 (残基 1 ～残基 25) を Gαi1 (残基 1 ～残基 18) で置換した mini-Gs 足場に基づいて生成されました。元の Gαs α-ヘリックスドメイン (AHD、V65-L203) の位置にある GGGSGGSGG リンカーとヒト Gi1 (G60-K180) の位置。 HEK293 細胞では、modGαs キメラは、SPE、DMCHA、PEA、または CAD の刺激に応答した mTAAR9 活性化の下流の G タンパク質解離アッセイにおいて同様の薬理学的プロファイルを示します。ｉ１、ＳＰＥ（ｉ）、ＤＭＣＨＡ（ｊ）、ＰＥＡ（ｋ）、およびＣＡＤ（ｌ）の用量反応曲線は、ｍＴＡＡＲ９過剰発現細胞においてＧαｏｌｆ－Ｇβγまたは修飾Ｇαｏｌｆ（ｍｏｄＧαｏｌｆ）－Ｇβγ解離を誘導した。値は、3 回の独立した実験の平均 ± SEM として表されます (n = 3)。 scFv16の結合を促進するために、GolfのN末端(残基1から残基27)をGαi1(残基1から残基18)に置換したミニゴルフ足場に基づいて改変Gαolfキメラを生成した。 modGαolf は昆虫細胞で発現および精製され、クライオ EM 研究用に mTAAR9 複合体を安定化しました。 HEK293 細胞では、修飾 Gαolf キメラは、SPE、DMCHA、PEA、または CAD に応答した mTAAR9 活性化の下流の G タンパク質解離アッセイにおいて同様の薬理学的プロファイルを示します。 mq、in vitro で再構成された SPE-mTAAR9-Gs-scFv16 複合体 (m)、PEA-mTAAR9-Gs-scFv16 複合体 (n)、PEA-mTAAR9-Golf-scFv16 複合体 (o)、DMCHA-mTAAR9-Gs の代表的な溶出プロファイル-scFv16 複合体 (p)、および CAD-mTAAR9-Gs-scFv16 複合体 (q)。 Superose 6 Increase 10/300 カラムとサイズ排除クロマトグラフィーピークの代表的な SDS-PAGE 結果。

a、SPE-mTAAR9-Gs 粒子の代表的な Cryo-EM 顕微鏡写真および二次元 (2D) クラス平均 (スケールバー: 100 nm)。 7132 本の映画からの代表的な Cryo-EM 顕微鏡写真と、3D 分類後に約 193217 個の粒子を使用して決定された代表的な 2 次元クラス平均が示されました。 b、SPE-mTAAR9-Gs 粒子の三次元 (3D) 分類のフローチャート。 7,132 本の映画からの代表的な Cryo-EM 顕微鏡写真と、3D 分類後に約 193,217 個の粒子を使用して決定された代表的な 2D クラス平均が示されています。 SPE-mTAAR9-Gs複合体構造に対して受容体のみのマスクを実施しました。その結果、SPE-mTAAR9-Gs複合体の受容体領域のマスクにより、mTAAR9の特定領域のマップ品質が大幅に向上することが示されました。 c、SPE-mTAAR9-Gs粒子の最終的な3D密度マップのフーリエシェル相関曲線。 FSC 0.143 カットオフでは、マップの全体的な解像度は 3.5 Å です。 d、SPE-mTAAR9-Gs三量体複合体の局所解像度（Å）に従って色付けされた3D密度マップ。 e、PEA-mTAAR9-Gs粒子の代表的なCryo-EM顕微鏡写真および2Dクラス平均（スケールバー：100nm）。 8025 個の映画からの代表的な Cryo-EM 顕微鏡写真と、3D 分類後に約 463012 個の粒子を使用して決定された代表的な 2 次元クラス平均が示されました。 f、PEA-mTAAR9-Gs粒子の3D分類のフローチャート。 8,025 本の映画からの代表的な Cryo-EM 顕微鏡写真と、3D 分類後に約 463,012 個の粒子を使用して決定された代表的な 2D クラス平均が示されています。我々は、PEA-mTAAR9-Gs複合体構造に対して受容体のみのマスクを実施した。その結果、PEA-mTAAR9-Gs複合体の受容体領域のマスクにより、mTAAR9の特定領域のマップ品質が大幅に向上することが示されました。 g、PEA-mTAAR9-Gs粒子の最終的な3D密度マップのフーリエシェル相関曲線。 FSC 0.143 カットオフでは、マップの全体的な解像度は 3.0 Å です。 h、PEA-mTAAR9-Gs三量体複合体の局所解像度（Å）に従って色付けされた3D密度マップ。 i、CAD-mTAAR9-Gs複合体におけるmTAAR9のN末端、ECL1およびECL2、Olfr78（AlphaFold 2によって予測）、β2AR（PDB：3SN6）およびD1R（PDB：7X2F）の三次元（3D）表示。 β2AR-Gs複合体の結晶構造やD1R複合体のEM構造には、N末端の電子密度やEM密度は観察されません。 β2AR と D1R の N 末端は乱れていると考えられます。 Alphafold2 が予測した Olfr78 構造では、N 末端が ECL1 と ECL2 の間に挿入されています。対照的に、mTAAR9 の N 末端は ECL1 を横切り、ECL2 の先端に達します。

ac、Cryo-EM 密度マップとモデルは、SPE-mTAAR9 のグローバルマップを使用して、mTAAR9 の TM1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM6、TM7 および SPE-mTAAR9-Gs 複合体における Gαs/Gαolf の α5 ヘリックスについて示されています。マップ閾値が 0.0255 の -Gs 複合体 (a)、マップ閾値が 0.0160 の PEA-mTAAR9-Gs 複合体のグローバルマップを使用した PEA-mTAAR9-Gs 複合体 (b)、PEA-mTAAR9-Golf 複合体では、マップしきい値が 0.0600 の PEA-mTAAR9-Golf 複合体のグローバルマップ (c)。 Chimera で「カラーゾーン」ツールを使用する場合、カラー半径を 3 Å に設定します。

a、Cryo-EM密度で観察された、または観察される可能性があり、質量分析法（MS）によって同定されたC22Nter:C186ECL2ジスルフィド結合ペアの分析の概要。この保存されたジスルフィド結合は、TAAR1 を除くほとんどの TAAR メンバーについて Alphafold2 によっても予測されました。 TAAR の細胞外領域の EM 密度は、PEA-mTAAR9-G および PEA-mTAAR9-Golf 構造内の潜在的なジスルフィド結合を同定するには十分ではありませんでしたが、質量分析データは、apo-mTAAR9、PEA-mTAAR9-Golf 複合体が結合していることを示唆しました。、PEA-、SPE-、DMCHA-mTAAR9-G、およびSPE-mTAAR5複合体はすべて、この保存されたジスルフィド結合を持っています。 SPE-mTAAR9-Gs および DMCHA-mTAAR9-Gs 構造における C22Nter:C186ECL2 ペアのジスルフィド結合の潜在的な Cryo-EM 密度を補足図 9 に示します。bg、代表的な高エネルギー衝突解離 (HCD) スペクトル。 PEA-mTAAR9-Gs 複合体 (b) SPE-mTAAR9-Gs 複合体 (c)、DMCHA-mTAAR9-Gs 複合体 (d)、PEA-mTAAR9-Golf 複合体 (e)、apo におけるジスルフィド結合 C22Nter:C186ECL2 ペアの同定MSによる-mTAAR9（g）とTMA-mTAAR5（f）のジスルフィド結合C24Nter:C188ECL2ペア。 NEM、メチルマレイミド。 h、AlphaFold2によって予測されたapo-mTAAR9の3つのジスルフィドパターン(C22Nter:C186ECL2ペアを含む)の概略図。 i、mTAAR9、mTAAR4、mTAAR5、およびmTAAR8cのC14Nter:C97ECL1ジスルフィドペアおよびC22Nter:C186ECL2ジスルフィドペアの主要な残基変異が、それぞれのアゴニスト(SPE、PEA、TMA、および1-MPD)によって誘導される受容体活性に及ぼす影響。ヒートマップは、ΔpEC50 の値に従って色付けされます (ΔpEC50 = 変異体の pEC50 - 野生型の pEC50)。 ND、信号が検出できません。値は 3 回の独立した実験から平均されました (n = 3)。 jm、それぞれSPE、CAD、PEA、およびDMCHAによって誘導される活性に対する、mTAAR9のジスルフィドペア、C14Nter:C97ECL1ペアおよびC22Nter:C186ECL2ペアの重要な残基変異の用量反応曲線。値は、3 回の独立した実験の平均 ± SEM として表されます (n = 3)。 np、mTAAR8c (n)、mTAAR5 (o)、および mTAAR4 (p) のジスルフィドペア、C14Nter:C97ECL1 ペアおよび C22Nter:C186ECL2 ペアの主要な残基変異の、それぞれのアゴニストによって誘導される活性に対する用量応答曲線 (1-MPD) 、TMA、PEA）。値は、3 回の独立した実験の平均 ± SEM として表されます (n = 3)。

SPE、DMCHA、PEA-mTAAR9-G の複合構造では、SPE と DMCHA の EM 密度は 3 つの異なるモードに配置でき、PEA は 2 つの潜在的なモードに配置できます。分子動力学（MD）シミュレーションの後、さらなる構造解析と生化学的特性評価には、PEA、SPE、および DMCHA の 1 つのモードのみが使用されました（補足の図 11 ～ 12 も参照）。しかし、mTAAR9 リガンドポケット内の CAD 結合モードを正確に定義することはできず、CAD の複数の立体構造が現在の EM 密度に適合する可能性がありました。 a、SPE-mTAAR9-Gs 複合体における SPE の 3 つの異なるモードに対応する EM 密度。 SPE モード 1: 緑色、SPE モード 2: オレンジ、SPE モード 3: 青色。 b、モード 1、モード 2、およびモード 3 における SPE と mTAAR9 間の詳細な相互作用の 3D 表示。水素結合は赤い破線で示されています。 c、SPEに結合したmTAAR9の3つの結合モードにおける相互作用パターンのバーコード表示。 SPEと相互作用する残基は緑色の円で示され、モード1またはモード2でのみ相互作用する残基は水色の円で示され、モード3でのみ相互作用する残基はオレンジ色の円で示されます。 d、分子力学MM-PBSA法57によって計算された、SPE-mTAAR9-Gs複合体の2つのモードにおけるmTAAR9の結合部位残基の結合エネルギー寄与の比較。 SPE モード 1: 緑色、SPE モード 2: オレンジ。 e、SPEによる刺激に応答したmTAAR9の3つのSPE結合モードにおける相互作用残基の変異の影響。ヒートマップは、ΔpEC50 の値に応じて色分けされます。値は 3 つの独立した実験から得たものです (n = 3)。モード 1 では相互作用するがモード 3 では相互作用しない残基の変異は水色の背景で示され、モード 3 でのみ相互作用する残基の変異はオレンジ色の背景で示されます。 f、3回の200ns MDシミュレーション中のSPE-mTAAR9-Gs複合体の3つのモードにおけるSPEおよび結合部位残基の平均RMSD値。特に、SPEの結合モード1とモード2は非常に似ていましたが、SPE-mTAAR9-GのSPEのN5が異なる位置に配置され、おそらくSPEの線形構成が原因ですべてEM密度によく適合する可能性があることを除きます。他のモード (モード 2) と比較して、SPE による結合モード (モード 1) は、リガンドが F1173.37 に近く、中央の N5 が Y2746.51 に近い場合に低いエネルギーを示しました。さらに、F1173.37A を変異させると、SPE 刺激に応答した mTAAR9 活性化が有意に減少しました。 MD 分析による結合ポケットに位置する各残基の結合エネルギー寄与のさらなる分析により、結合モード 1 がモード 2 よりも優れた安定性を示すことが確認されました。モード 3 では、SPE は T1093.29、F1684 との特異的相互作用を失いました。 61、W2716.48、V3007.42、Y2937.35と新たな接点を形成した。注目すべきことに、Y293A変異はSPE誘導性mTAAR9活性化に有意な影響を示さなかったにもかかわらず、T1093.29A、F1684.61A、W2716.48AまたはV3007.42Aの変異はSPE誘導性mTAAR9活性化を有意に減少させるか完全に消失させた。さらに、MD シミュレーションでは、モード 3 がモード 1 およびモード 2 よりも安定性が低いことが示唆されました。そのため、さらなる生化学的特性評価には主に SPE のモード 1 を使用しました。

我々は、AlphaFold2 を使用してマウス Olfr2 および Olfr78 の構造を予測し、SiteMap アルゴリズムを使用してそれらの対応するリガンドポケットを予測しました。次に、分子ドッキングとMDシミュレーションを実行して、報告されている臭気物質受容体であるOlfr2とOlfr78のリガンドポケット内のオクタナールとプロピオン酸塩の間の相互作用をさらに調査しました。 a、ドーパミン-D1R-Gs複合体のリガンド結合ポケットの断面図（PDB:7CKZ、左）、AlphaFold2およびMDシミュレーションによって生成されたOctanal-Olfr2複合体（中央）およびMS47134-MRGPRX4-Gq（PDB） :7S8P、右)。 b、AlphaFold2 によって予測された Olfr2 および Olfr78 構造の図。 c、SiteMap アルゴリズムを使用して決定された Olfr2 (左パネル) および Olfr78 (右パネル) の予測リガンド結合ポケット。 Olfr2 の予測された結合ポケットは、緑、黄、オレンジ、シアン、または青のボールで満たされています。 Olfr78 が予測した結合ポケットは、赤、緑、ピンク、青、またはシアンのボールで満たされています。 d、3回の200 nsのMDシミュレーション中のオクタナール（上のパネル）およびオクタナールと直接相互作用するOlfr2の主要な残基（下のパネル）の平均RMSD値。 e、3回の200nsのMDシミュレーション中のプロピオン酸塩（上のパネル）およびプロピオン酸塩と直接相互作用するOlfr78の主要な残基（下のパネル）の平均RMSD値。 f、mTAAR9の結合ポケットの構造と、AlphaFold2によるOlfr2およびOlfr78の予測構造に基づいて分子ドッキングによって生成されたマウスオクタナール-Olfr2およびプロピオン酸Olfr78の模擬構造との構造比較。両方の臭気物質受容体のリガンドポケットは、4 つのヘリックス、TM3 ～ TM6 によって定義されました。対照的に、mTAAR9 のリガンドポケットは追加の TM7 によって定義され、より多くの相互作用を提供する可能性があります。もう1つの注目すべき違いは、mTAAR9のリガンドがOlfr2またはOlfr78内の予測リガンドよりも深く結合し、大きな疎水性残基W6.48との直接接触を形成することである。 Olfr2 または Olfr78 では、大きな疎水性残基 W6.48 が小さな残基 Y6.48 に置き換えられ、対応するリガンドと直接接触しません。

a、異なるヒトおよびマウスのTAARメンバーにおけるD/E3.32-W6.48-Y7.43モチーフの配列アラインメント。これらの 3 つの保存された残基は、水色の背景で強調表示されています。 b、それぞれのアゴニスト（SPE、PEA、 TMA、および 1-MPD)。ヒートマップは、ΔpEC50 の値に従って色付けされます (ΔpEC50 = 変異体の pEC50 - 野生型の pEC50)。 ND、信号が検出できません。値は 3 回の独立した実験から平均されました (n = 3)。 c、mTAAR9 (d)、mTAAR8c (e)、mTAAR5 (f)、および mTAAR4 (g) の D3.32-W6.48-Y7.43 モチーフおよび C/S3.36 の重要な残基変異の用量応答曲線それぞれのアゴニスト (SPE、1-MPD、TMA、PEA) による刺激に反応します。値は、3 回の独立した実験の平均 ± SEM として表されます (n = 3)。保存された C/S3.36 は D/E3.32 の主鎖と水素結合相互作用を形成する可能性がありますが、mTAAR9、mTAAR4、mTAAR5、および mTAAR8c で C3.36 を A に変異させても、匂い誘発性の活性化には有意な影響を引き起こしませんでした。これは、C/S3.36 を介した D/E3.32 の主鎖との H 結合の役割が通常の TAAR 受容体の活性化には必要ないことを示唆しています。

a、SPEによる刺激に応答した、受容体(mTAAR1-6、7d、8c、および9)を過剰発現するHEK293細胞におけるGαs-Gβγ解離の用量応答曲線。値は、3 回の独立した実験の平均 ± SEM として表されます (n = 3)。 b、3回の200ns MDシミュレーション中のSPE（上のパネル）およびSPE-mTAAR5複合体中の結合部位残基の平均RMSD値。全体的なMDシミュレーション構造を補足図14bに示しました。 SWISS-MODEL を介して、解決した mTAAR9 構造をテンプレートとして使用して、mTAAR5 の座標を構築しました。 c、SPEとmTAAR5のD1143.32、Y2957.34残基間の詳細な相互作用の3D表示。 de、SPEによる刺激に応答した、mTAAR9 (d)およびmTAAR5 (e)のポリアミン認識ポケットにおける重要な残基変異の用量応答曲線。値は、3 回の独立した実験の平均 ± SEM として表されます (n = 3)。 f、mTAAR6、mTAAR7d、およびmTAAR8cの構造的に同等な変異の潜在的な影響の構造図。ポリアミン認識ポケット (T3.29 および T1133.33) 内の保存された相互作用は、mTAAR6 では V1133.33 から T、mTAAR7d では S1243.39 および G1283.33 から T、および S1083.29 と V1123 の変異を生成することによって模倣されました。 mTAAR8c の 33 から T。 g、SPE刺激に応答した、mTAAR6、mTAAR7d、mTAAR8c、および図4fによるポリアミン認識ポケット内の示された変異体を過剰発現するHEK293細胞の用量反応曲線。値は、3 回の独立した実験の平均 ± SEM として表されます (n = 3)。

ａ、ＰＥＡによる刺激に応答した受容体（ｍＴＡＡＲ２－６、７ｄ、８ｃ、および９）過剰発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＧαｓ－Ｇβγ解離の効力および有効性。ヒートマップは、3 つの独立した実験からの pEC50 および Emax の値に従って色付けされます (n = 3)。 ND、信号が検出できません。 b、PEAによる刺激に応答した受容体(mTAAR2-6、7d、8c、および9)過剰発現HEK293細胞におけるGαs-Gβγ解離の用量応答曲線。値は、3 回の独立した実験の平均 ± SEM として表されます (n = 3)。 c、SPEによる刺激に応答した、mTAAR9のSPE結合疎水性ポケットにおける重要な残基の変異の影響。ヒートマップは、ΔpEC50 の値に従って色付けされます (ΔpEC50 = 変異体の pEC50 - 野生型の pEC50)。値は 3 つの独立した実験から得たものです (n = 3)。 d、SPEによる刺激に応答した、mTAAR9のSPE結合疎水性ポケットにおける重要な残基の変異の用量応答曲線。値は、3 回の独立した実験の平均 ± SEM として表されます (n = 3)。一貫して、F1173.37T、F1684.61V、Y2746.51C、V2977.39T/C、および V3007.42A/G のこれら 4 つの疎水性残基の構造的に同等な変異は、SPE 誘導性の mTAAR9 活性化を減少させました。 ef、SPEに応答した、mTAAR9の野生型および変異体(F1684.61LおよびV3007.42A)(c)、またはmTAAR5の野生型および変異体(L170F4.61およびA2947.42V)(d)を過剰発現するHEK293細胞の用量反応曲線刺激。値は、3 回の独立した実験の平均 ± SEM として表されます (n = 3)。実際、mTAAR9におけるF1684.61LおよびV3007.42Aの変異は、SPE誘導性受容体活性化をそれぞれ5.13±0.66倍および27.2±5.04倍減少させた(e)のに対し、mTAAR5におけるL1704.61FおよびA2947.42Vの変異はSPEを増加させた。受容体活性化はそれぞれ5.43±0.55倍および9.26±0.68倍刺激された(f)。これらの結果は、これら 2 つの残基の結合が、2 つの mTAAR メンバー間で作用する SPE の効力の差に寄与していることを示唆しています。 g、PEAによる刺激に応答したmTAAR9のPEA結合ポケットにおける重要な残基の変異の影響。ヒートマップは、ΔpEC50 の値に従って色付けされます (ΔpEC50 = 変異体の pEC50 - 野生型の pEC50)。値は 3 つの独立した実験から得たものです (n = 3)。 h、PEAによる刺激に応答した、mTAAR9のPEA結合疎水性ポケットにおける重要な残基の変異の用量応答曲線。値は、3 回の独立した実験の平均 ± SEM として表されます (n = 3)。特に、mTAAR4/6/7d/9 の 4 つの残基を、F/Y3.37L/T、Y6.51C、Y7.35L、または V7.39T/C などの他の mTAAR に存在する構造的に同等の残基に変異させると、 PEA 誘導性の mTAAR9 活性。ｉ、ＰＥＡによる刺激に応答したｍＴＡＡＲ７ｄのＰＥＡ結合ポケットにおける重要な残基の変異の影響。ヒートマップは、ΔpEC50 の値に従って色付けされます (ΔpEC50 = 変異体の pEC50 - 野生型の pEC50)。値は 3 つの独立した実験から得たものです (n = 3)。 j、Gαs-Gβγ解離アッセイによる、PEAによる刺激に応答したmTAAR7dの主要な残基の変異の用量反応曲線。値は、3 回の独立した実験の平均 ± SEM として表されます (n = 3)。特に、mTAAR4/6/7d/9 の 4 つの残基を、F/Y3.37L/T、Y6.51C、Y7.35L、または V7.39T/C などの他の mTAAR に存在する構造的に同等の残基に変異させると、 PEA 誘導性の mTAAR7d 活性。

a、apo-mTAAR9 のシミュレートされた構造 (シアン) と、AlphaFold2 によって生成された apo-mTAAR9 のモデル (グレー) の比較。 b、3回の200nsのMDシミュレーション中のapo-mTAAR9の平均RMSD値。 c、SPE-mTAAR9 (青色) のクライオ EM 構造と apo-mTAAR9 のシミュレートされたモデル (灰色) の比較。 mTAAR9 のアゴニスト結合構造における TM6 の細胞質末端は顕著な外側への移動を示すのに対し、TM1 の細胞外末端は内側への移動を示します。 d、不活性β2AR（シアン）、β2AR-Gs複合体（薄緑色、PDB：3SN6）、不活性mTAAR9（灰色）、mTAAR9-Gs複合体（水色）におけるTM3とTM6の構造比較。 mTAAR9およびβ2ARの対応する構造を比較すると、これらのアゴニストとトグルスイッチW2716.48との直接相互作用が、TM3を用いた2つの隣接するヘリックスに位置するF2676.44およびA2636.40の下方へのシフトを伴い、その下方への移動を推進したことが示される。参考に。また、mTAAR9 における A2636.40 による I2786.40 の β2AR への置換により、mTAAR9 における TM3 と TM6 間の分離角は活性型 β2AR よりも大きくなりました。これは、この置換が保存された R1303.50 との相互作用を破壊するためです。 e、受容体活性化に重要なTM6の主要な残基におけるTAARメンバーおよび選択されたクラスA GPCRファミリーメンバーの配列アラインメント。保存された残基は赤いフォントで強調表示されます。重要なのは、W2716.48 と F2676.44 は、TAAR5 メンバーが Y6.44 であることを除いて、TAAR ファミリー全体で保存されており、保存されたトグルスイッチ W6.48 と F/Y6.44 およびパッキングの構造変化が示唆されています。 TM3 と TM6 の間の変化は、Gs/Golf と共役した TAAR 活性化を媒介する潜在的な共通メカニズムです。 f、PEA誘導性のmTAAR9-GolfまたはmTAAR9-Gs活性に対するA2636.40IおよびA2636.40Lを含むA6.40、ならびにTMA誘導性のmTAAR5-GolfまたはmTAAR5-Gsに対するA2576.40IおよびA2576.40Lの変異影響活性は、Gαs-Gβγ 解離アッセイによって評価されました。ヒートマップは、ΔpEC50 の値に従って色付けされます (ΔpEC50 = 変異体の pEC50 - 野生型の pEC50)。値は 3 つの独立した実験から得たものです (n = 3)。 gj、Gαs/olf-Gβγ解離アッセイによる、PEAまたはTMAによる刺激に応答した、mTAAR9 (gh)またはmTAAR5 (ij)におけるA6.40IおよびA6.40Lを含む、A6.40の残基変異の用量反応曲線。値は、3 回の独立した実験の平均 ± SEM として表されます (n = 3)。

a、GsとのmTAAR9結合界面の詳細な表現。界面は、ICL2、TM3、TM5、TM6の細胞質末端、mTAAR9のヘリックス8（中程度のアクアマリン）およびGのα4-β6ループ、α5ヘリックス、β2-β3ループ（ピンク）で構成されています。 b、Gαs の α5 ヘリックスの C 末端と mTAAR9 の間の詳細な相互作用の 3D 表示。Y391G.H5.23 および L388G.H5.20 は、V1343.54 によって作成された疎水性表面と広範な接触を形成します。 mTAAR9 の I2205.61、A2245.65、Q2275.68。 c、Y391G.H5.23、E392G.H5.24、Gαsのα5ヘリックスのC末端カルボキシレート末端とmTAAR9のR1303.50、K2556.32の間の詳細な相互作用の3D表示。水素結合距離は赤い破線で示されています。 Y391G.H5.23 は、R1303.50 と π: カチオン相互作用を起こします。 E392G.H5.24およびGαsのα5ヘリックスのC末端カルボキシレート末端は、mTAAR9のK2556.32とH結合または電荷-電荷相互作用を形成しました。 d、mTAAR9のICL2とαN、β2-β3ループ、およびGのα5ヘリックスとの結合界面の全体構造。 e、mTAAR9のY140ICL2、P137ICL2、L138ICL2とH41G.S1.02、V217G.S3.01、F376G.H5.08、C379G.H5.11、R380G.H5.11、I383G.H5との間の詳細な相互作用の3D表示Gαの.15、Q384G.H5.16、H387G.H5.19、Y391G.H5.23。 P137ICL2 と L138ICL2 は、H41G.S1.02、V217G.S3.01、C379G.H5.11、F376G.H5.08、R380G.H5.12、I383G.H5.15、および Q384G によって作成された疎水性クレーター内に位置しています。 GαsのH5.16。 Y140ICL2 は、H387G.H5.19 および Y391G.H5.23 との π:π 相互作用に関与しています。 P137ICL2 と L138ICL2 は、Gα の β1-β3 鎖と α5 ヘリックスによって作られた疎水性クレーター内に位置しています。 f、GαsのC末端α5ヘリックスとmTAAR9のH8の最初のセグメントとの間の詳細な相互作用の3D表示。水素結合距離は赤い破線で示されています。 g、Gαs の V287G.S5.02 と比較して、Gαolf の I274G.S5.02 は、I263G.H3.12、W264G.H3.13、および F260G.H3.0 と密接に関連しています。 mTAAR9 の H8 の最初のセグメントでは、Y3158.47 と W3178.49 が 1 つの側壁を構成し、Gαs の C 末端 α5 ヘリックスのフック端を収容し、R1303.50 と水素結合を形成して mTAAR9 の活性構造を安定化します。。 h、mTAAR9-Golf 界面 (Golf は中紫色) と mTAAR9-Gs 界面 (Gs はピンク色) の違いの 3D 構造表示。 Gαolf の K343G.h4s6.12/D341G.h4s6.10 と Gαs の R356G.h4s6.12/D354G.h4s6.10 の比較。水素結合距離は赤い破線で示されています。 Gαolf の K343G.h4s6.12 および D341G.h4s6.10 は、Gαs の構造的に同等な R356G.h4s6.12 および D354G.h4s6.10 ペアと比較して、より弱い電荷-電荷相互作用を形成し、より分離されています。 i、mTAAR9のV134ICL2とV2235.64、GαolfのL375G.H5.20およびQ371G.H5.16の間の詳細な相互作用の3D表示、およびこれらの相互作用とmTAAR9のV134ICL2とV2235.64およびL388G.H5の間の相互作用の重ね合わせ。 Gαsの20とQ371G.H5.16。 TMD の細胞質末端の構造変化により、mTAAR9 の V2235.64 および V1343.54 と、Gαolf の Q371G.H5.16 および L375G.H5.20 とのより緊密な相互作用が可能になりました。 Gs に結合した mTAAR9 は中色のアクアマリンで示され、Golf に結合した mTAAR9 はホットピンクで示され、Gs はピンク色で示され、Golf は中程度の紫色で示されます。 j、mTAAR9のR3198.51とGαolfのE379G.H5.24またはGαsのE392G.H5.24の間の詳細な相互作用の3D表示。 Gαolf の α5 ヘリックスの C 末端では、E379G.H5.24 は、Gαs の場合と比較して、mTAAR9 の R3198.51 とより強い電荷-電荷相互作用を形成します。 k、mTAAR9のP141ICL2、F144ICL2とGαsのR38G.hns1.02の間の相互作用と比較した、mTAAR9のP141ICL2、F144ICL2とGαolfのK31G.hns1.02の間の詳細な相互作用の3D表示(f)。水素結合距離は赤い破線で示されています。 mTAAR9のICL2はGαsおよびGαolfの両方と同様の相互作用パターンを形成しますが、GαsのR38G.hns1.02をGαolfのK31G.hns1.02に置換すると、mTAAR9のP141ICL2および主鎖F144ICL2との相互作用が消失しました。

このファイルには補足図が含まれています。 1 ～ 21 および補足表 1 ～ 10。

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転載と許可

Guo, L.、Cheng, J.、Lian, S. 他哺乳類の嗅覚受容体によるアミン臭気物質の知覚の構造基盤。 Nature 618、193–200 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41586-023-06106-4

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受信日: 2022 年 10 月 14 日

受理日: 2023 年 4 月 20 日

公開日: 2023 年 5 月 24 日

発行日: 2023 年 6 月 1 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06106-4

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