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Nature Communications volume 13、記事番号: 6909 (2022) この記事を引用

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2 引用

13 オルトメトリック

メトリクスの詳細

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌分離株の出現は、さらなる抗生物質の開発が緊急に必要であることを浮き彫りにしています。 ClpP は、細菌およびミトコンドリアの ATPase によって制御される高度に保存されたプロテアーゼです。 細菌のClpPの異常な活性化は抗生物質を発見する代替方法であるが、ヒトのClpP機能の妨害を回避できる選択的な黄色ブドウ球菌のClpP活性化剤を開発することは依然として困難である。 ここでは、構造ベースの設計を使用して、(R)-および(S)-ZG197 を高選択性黄色ブドウ球菌 ClpP アクチベーターとして同定します。 ホモ・サピエンスClpPの主要な構造要素、特にW146とそのC末端モチーフとの共同作用は、活性化因子の識別に大きく寄与する。 当社の選択的活性化剤は、in vitro で一連の多剤耐性ブドウ球菌株に対して幅広い抗生物質特性を示し、ゼブラフィッシュおよびマウスの皮膚感染モデルにおいて有望な抗生物質効果を示します。 我々の発見は、黄色ブドウ球菌ClpPの種特異的活性化因子がブドウ球菌感染症を治療するための刺激的な治療薬であることを示している。

黄色ブドウ球菌 (S. aureus) は人間の皮膚や鼻孔に定着し、侵襲的で生命を脅かす病気を頻繁に引き起こします1。 メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）は、手術部位感染、菌血症、敗血症など、多くの院内感染の原因となります2。 MRSA は、β-ラクタム、セファロスポリン、フルオロキノロン、アミノグリコシド、テトラサイクリン、マクロライド、トリメトプリム スルファメトキサゾール 3 を含む多くの抗生物質に対して多剤耐性を獲得しています。 この耐性のため、MRSA 感染症を抗生物質で予防すると、クロストリジウム ディフィシル感染症などの院内疾患が頻繁に誘発されます4。 強力な抗生物質の供給が減少していることを考慮すると、多剤耐性 MRSA 感染症を治療する新しい方法を開発することがますます重要になっています5。 この目的を達成するために、将来の MRSA 感染症の治療法を提供するには、抗ブドウ球菌薬、特に異なる作用機序を持つ抗ブドウ球菌薬の開発が緊急に必要とされています6、7、8、9、10、11。

カゼイン分解プロテアーゼ P (ClpP) は、細菌およびヒトのミトコンドリアにおいて ATPase によって制御される高度に保存されたプロテアーゼであり、ミスフォールドまたは損傷したタンパク質を制御および分解することにより、タンパク質の品質管理において重要な役割を果たしています 12,13。 細菌では、ClpP は病原性因子の発現、抗生物質耐性、バイオフィルムと持続物質の形成の調節に関与しています 14、15、16、17。 同様に、ミトコンドリアに存在するホモ・サピエンス ClpP (HsClpP) は、ミトコンドリアタンパク質の恒常性を制御する重要なプロテアーゼです。 これらのタンパク質は主に呼吸鎖複合体に関与しています18。 HsClpP の発現または組織分布の調節不全は、がんや神経障害などの疾患と強く関連しています 19,20。

小分子活性化因子による ClpP の機能不全は、抗菌薬や抗がん剤を発見する可能性のある方法であることが最近証明されました 21。 注目すべきことに、アシルデプシペプチド（ADEP）は有望な抗生物質のクラスとして同定されており、細菌のClpPが抗生物質の標的となる可能性があることが明らかになりました22,23。 これらの天然に存在する活性化因子は、黄色ブドウ球菌 ClpP (SaClpP) をアロステリックに機能獲得状態に切り替えて、繊維状温度感受性 Z (SaFtsZ) などの複数の必須タンパク質を分解します。これにより、細胞分裂が阻害され、最終的には細菌細胞死が引き起こされます 24 、25。 さらに、ADEP 4 は、市販の抗生物質と組み合わせると持続菌の増殖を抑制し、慢性バイオフィルム感染を根絶します 23 。これは、ADEP の治療用途が併用療法で使用できることを示しています。 しかし、ADEP 類似体の化学的不安定性の問題により、抗生物質創薬の応用が大幅に制限される可能性があります 26。 細菌のClpP活性化因子としてADEPが発見されたことは、HsClpPに関する研究に影響を与えた。 HsClpP プロテアーゼ活性の異常な活性化により、呼吸鎖複合体の複数のタンパク質が大幅に分解され、抗腫瘍効果が発揮されます 27。 注目すべきことに、ADEP 4 の類似体である ADEP-28 は、HsClpP を活性化し、固有のカスパーゼ依存性アポトーシスを活性化することによって細胞傷害効果を誘導することが示されました 28。 さらに、イミプリドン ONC201 および ONC212 は HsClpP プロテアーゼを活性化し、ClpP 媒介タンパク質分解を促進し、その結果、癌細胞の致死性をもたらします 27,29。 ONC212 は抗生物質としても機能し、生化学的および遺伝的アッセイにおいて大腸菌、枯草菌、および黄色ブドウ球菌の ClpP を活性化し、最終的に細菌細胞の増殖を抑制します 30。 最近、ONC212 と ADEP 4 が XooClpP を調節不全にして XooFtsZ を分解することを発見しました。これは葉枯れ病の治療戦略として有望であることを示唆しています 31。 ベンガミド類似体や自己区画化プロテアーゼ (ACP) の活性化因子などの他の活性化因子も、ClpP32、33、34 に対して特定の活性を示します。 しかし、現在まで、SaClpP プロテアーゼに対する種特異的な活性化因子は存在しません。

この研究では、HsClpP ではなく SaClpP を選択的に活性化する 2 つの高度に選択的な SaClpP 活性化因子、(R)-および (S)-ZG197 について報告します。 さらに、(R)-ZG197 は一連の MRSA 株に対して広範囲の抗生物質特性を示し、in vivo で有望な抗生物質効果を示します。

ADEP 4 と ONC212 は ClpP プロテアーゼのグローバルな活性化因子であるため (補足図 1a)、私たちの目標は、HsClpP よりも SaClpP プロテアーゼ活性を選択的に強化する小分子活性化因子を開発することです (図 1a)。 ClpP 活性化因子としての ADEP 4 と ONC212 の構造活性関係が確立されている 29,35,36,37,38 ことを考慮して、我々は SaClpP の選択的活性化因子としての異なる化学的足場を探索します。 この目的を達成するために、3,896 個の候補を含む化合物ライブラリに対してハイスループット スクリーニング (HTS) を実施しました。 ICG-001は、SaClpPの存在下でフルオレセインイソチオシアネート標識カゼイン（FITCカゼイン）の加水分解を促進することが確認されました（補足図1bおよび1c）。 ICG-001 は当初、Wnt シグナル伝達経路阻害剤として特徴付けられていましたが、最近では HsClpP39,40 の活性化剤としてスクリーニングされました。 ICG-001 の明確な足場と誘導体の実用的な合成を考慮して、我々はフォローアップ合成最適化の開始点として ICG-001 を選択しました 41。 イソロイシンフラグメントおよび4,4,4-トリフルオロブチルモチーフをICG-001のコア足場に組み込むと、強力なClpP活性化因子ZG180が提供されました（図1b）。 EC50の3倍の減少によって証明されるように、ZG180は、α-カゼイン加水分解のためのSaClpPの活性化においてICG-001よりも強力である（図1cおよび補足図1d）。 ただし、ZG180はα-カゼイン加水分解のHsClpPも促進します（図1cおよび補足図1e）。これは、ZG180が細菌およびミトコンドリアのClpPタンパク質の両方の包括的な活性化因子でもあることを示しています。

a この研究の目標は、選択的 SaClpP 活性化因子を開発することです。 b ClpP 活性化剤としての合成リード化合物 ZG180。 c ICG-001およびZG180の存在下での、それぞれSaClpPおよびHsClpPによるα-カゼイン加水分解の定量（n = 3の生物学的に独立した実験）。 データは平均値 ± SD (エラーバー) として表示されます。 ZG180/SaClpP (d) および ZG180/HsClpP (e) 複合体の X 線結晶構造。 複合構造体の側面図と上面図が表示されます。 SaClpP は灰色の漫画チューブで示され、HsClpP は小麦漫画チューブで示され、ZG180 はシアン色の球で示されます。 f、g 電子密度マップと、SaClpP (f) および HsClpP (g) の疎水性ポケットにおける ZG180 結合の拡大図。 fo-fc オミット マップは 3.0 Å で等高線が描かれ、緑色で色付けされています。一方、2fo-fc マップは 1.0 Å で等高線が描かれ、マゼンタで色付けされています。 ZG180はシアンの棒で表示されます。 水素結合は濃い破線で示され、距離はÅで表示されます。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

ClpP プロテアーゼのアクチベーター促進タンパク質分解の分子機構を調査するために、SaClpP (PDB の 7WID) と HsClpP (PDB の 7WH5) に結合した ZG180 の結晶構造をそれぞれ 1.90 Å と 2.13 Å の分解能で解析しました (補足)表1）。 ZG180/SaClpP 構造または ZG180/HsClpP 構造は、2 つの積み重ねられた七量体環から構成される単一の四量体です (図 1d、e)。 以前に特徴付けられたClpP活性化因子と同様に、14個のZG180分子の結合は、軸入口孔が拡大した4量体ClpPシリンダーのオープンゲート状態を誘導します42、43、44、45。 2fo-fcおよびfo-fc省略マップにおける見かけの電子密度は、SaClpPおよびHsClpPの頂端表面上のZG180結合を明確に示しています（図1f、g）。 ZG180 のナフチル モチーフとトリフルオロブチル鎖は、SaClpP の結合ポケットに疎水性スタッキングを形成し、相互作用の強化に寄与しています。 ZG180とD27、L49、Q52、Y61、およびQ89の側鎖間の水素結合のネットワークは、集合的にSaClpPへの結合親和性を増加させます（図1f）。 同様の結合様式がZG180/HsClpP構造でも観察されます（図1g）。 これらの構造的特徴は、ADEP 4/SaClpP、ADEP-28/HsClpP、および ONC201/HsClpP27、28、35 など、小分子活性化因子と結合した SaClpP と HsClpP の両方の以前に報告された構造複合体と類似しています。同様に疎水性ポケットに位置し、ATPase の ClpP への結合を防ぎます。

HsClpP よりも SaClpP に特異的な活性化因子を設計するために、我々は 2 つの ClpP タンパク質における ZG180 の結合様式に影響を与える可能性があるアミノ酸配列を分析しました。 SaClpPとHsClpPは一次配列で高い類似性を共有していますが（補足図2a）、HsClpPにはW146の大きなインドールモチーフがありますが、SaClpPには保存された位置にはるかに小さいI91のイソプロピル側鎖があります。 実際、ZG180/SaClpP複合体とZG180/HsClpP複合体の構造的重ね合わせからも、ZG180のナフチルモチーフのα炭素が、HsClpPのW146のかさ高い側鎖に対して立体衝突を導入するための識別部位である可能性が高いことが明らかになった（図1）。 2a)。 この目的を達成するために、ZG180にメチル基を組み込み、2つのナフタレン-1-イルメチル類似体（R）-および（S）-ZG197を得ました（図2b）。 ZG180と同様に、(R)-ZG197と(S)-ZG197は両方ともSaClpPを活性化し、in vitroでα-カゼインとSaFtsZを分解します（図2c、補足図2b、c）。 非選択的 ZG180 活性化因子とは異なり、(R)-ZG197 は EC50 値 1.5 μM で SaClpP を活性化し、これは HsClpP を活性化する活性よりも 20 倍高い活性ですが、(S)-ZG197 は 100 μM でも HsClpP を活性化できません (図2cおよび補足図2d)。 さらに、(R)-ZG197 と (S)-ZG197 は両方とも、組換え SaClpP タンパク質の補充により黄色ブドウ球菌 8325-4 clpP ノックアウト (ΔclpP) 株の細胞溶解物中の細胞 SaFtsZ タンパク質の分解を促進しますが、SaFtsZ の分解は促進しません。組換え HsClpP タンパク質の存在下で起こります。 対照的に、グローバルアクチベーターONC212は、SaClpPとHsClpPの両方を活性化して、細胞のSaFtsZタンパク質を分解します（図2d）。 結論として、我々は、構造ベースの設計を使用することにより、インビトロでミトコンドリアClpPの活性を最小限に阻害する種特異的SaClpP活性化因子(R)-および(S)-ZG197の開発に成功した。

HsClpPよりもSaClpPに対する選択的活性化因子を設計するための戦略を明らかにするための、ZG180/SaClpP複合体およびZG180/HsClpP複合体の構造の重ね合わせ。 SaClpP および HsClpP は、それぞれ灰色および小麦色の漫画チューブに示されています。 ZG180/SaClpP 構造では ZG180 はシアンに着色され、ZG180/HsClpP 構造では黄色に着色されます。 SaClpP の I91 と HsClpP の W146 は棒で示されています。 b (a)で概説した構造ベースの設計によって開発されたSaClpPアクチベーター(R)-および(S)-ZG197の構造。 キラルなメチル基は赤色で示されています。 c それぞれ(R)-および(S)-ZG197の存在下でのSaClpPおよびHsClpPによるα-カゼイン加水分解の定量(n = 3の生物学的に独立した実験)。 データは平均値 ± SD (エラーバー) として表示されます。 d clpP欠失(ΔclpP)変異体の細胞溶解物における、それぞれウシ血清アルブミン(BSA)、組換えSaClpP、およびHsClpPの補給による細胞SaFtsZタンパク質の分解に対する活性化因子の影響。 細胞内に存在する SaFtsZ の量は、ウェスタンブロットアッセイで定量されます。 SaFtsZ のバンド強度の定量化は、SaGAPDH のローディング コントロールに対して正規化されており、DMSO グループの比は 1.0 と見なされます。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

当社のアクチベーターが in vitro で HsClpP ではなく SaClpP を選択的に活性化する理由を説明するために、(R)- または (S)-ZG197 化合物と 2 つの ClpP プロテアーゼ間の直接相互作用を測定しました。 示差走査蛍光分析（DSF）分析中、（R）-ZG197は用量依存的にSaClpPの熱安定性を大幅に高めますが、HsClpPには弱い影響を与えます（図3a）。 これは、(R)-ZG197がHsClpPよりもSaClpPに対して強い結合親和性を示したことを示している。 同様に、(S)-ZG197 は SaClpP の融解温度 (Tm) を上昇させますが、HsClpP の Tm はほとんど変化しません (図 3b)。 次に、等温滴定熱量測定 (ITC) アッセイを実施して、結合能力の化学量論を決定しました。 SaClpP への (R)- および (S)-ZG197 の結合の解離定数 (Kd) は、それぞれ 2.5 ± 0.2 μM および 5.0 ± 0.3 μM と定量的に推定されます (図 3c)。 また、生物層干渉法 (BLI) でアクチベーターの SaClpP および HsClpP への結合を分析しました。 同様に、(R)-および(S)-ZG197は、SaClpPへの結合に関して、それぞれ58±4.8nMおよび470±60nMのKdを示します(補足図3a)。 ただし、(R)-ZG197 も (S)-ZG197 も、BLI 分析では HsClpP に対して検出可能な結合親和性を示しません (補足図 3b)。 これは、我々の活性化因子が in vitro で HsClpP ではなく SaClpP に選択的に結合することを示しています。

DSF アッセイにおける SaClpP および HsClpP の熱安定性に対する (R)-(a) および (S)-ZG197 (b) の影響。 Tm、融解温度。 c ITC滴定によるSaClpPへの(R)-および(S)-ZG197結合の決定。 解離定数 (Kd) と化学量論係数 (N) が示されています。 それぞれ細胞の SaClpP (d) および HsClpP (e) の熱安定性に対する活性化剤の影響。 黄色ブドウ球菌8325-4を、CETSAを実行する前に10μM化合物の存在下で2時間培養した(d)一方、HEK 293 T/17の細胞溶解物をCETSAでアッセイした(e)。 非加熱サンプル中のタンパク質が入力として使用され、100% とみなされます。 データ (a、b、d、および e) は 3 つの生物学的に独立した実験から得られ、平均 ± SD (誤差バー) として表示されます。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

次に、細胞サーマルシフトアッセイ（CETSA）を実行することにより、アクチベーターがブドウ球菌細胞のSaClpPと直接相互作用するかどうかを調査しました。 黄色ブドウ球菌8325-4株を10μMの(R)-または(S)-ZG197で培養した場合、SaClpPの熱安定性の大幅な増加が観察されました（図3dおよび補足図3c）。 細菌細胞を ONC212 で処理した場合にも、同様の SaClpP Tm の上昇が発生しました。 これは、当社の選択的アクチベーターとグローバル アクチベーター ONC212 がブドウ球菌細胞内の SaClpP プロテアーゼに直接結合できることを示しています。 また、HEK 293T/17 細胞株で CETSA を実行し、アクチベーターが HsClpP に結合するかどうかをテストしました。 DMSOと同様に、(R)-および(S)-ZG197はHEK 293 T / 17細胞におけるHsClpPの熱安定性に対する影響が最小限ですが、ONC212はHsClpPの安定性を大幅に増加させました（図3eおよび補足図3d）。 したがって、細胞結合アッセイの結果は、細胞内での HsClpP ではなく SaClpP に対するアクチベーターの直接的かつ選択的な相互作用を強調しており、これは in vitro 生物物理学的結合アッセイの結果と同様です。

SaClpP タンパク質分解における (R)- および (S)-ZG197' の選択的活性化のメカニズムについての構造的洞察を明らかにするために、(R)-ZG197/SaClpP (PDB の 7XBZ) および (S) の X 線結晶構造を決定しました。 )-ZG197/SaClpP (PDB の 7WGS) 複合体は、それぞれ 2.15 Å および 2.11 Å の解像度になります (補足表 1)。 解析された構造は、12の(R)-ZG197または14の(S)-ZG197アクチベーターがSaClpPの14の疎水性ポケットに結合することを示しており(補足図4a)、電子密度マップは(R)-および(それぞれS)-ZG197（図4a、b）。 (R)-ZG197 および (S)-ZG197 のナフチルモチーフは、キラルなメチル置換基により異なる方向を向いています。 (R)-および(S)-ZG197の両方のカルボニル基はSaClpPのH83と水素結合を形成し、Q52の側鎖も(R)-ZG197と直接または(S)-ZG197を介して水素結合を形成します。水の分子。 D27、L49の側鎖によって媒介される追加の水素結合は、共同して(S)-ZG197のSaClpPへの結合に寄与します(図4a、b)。 さらに、広範な疎水性相互作用が、SaClpPのリガンド結合部位の(R)-および(S)-ZG197で観察されます（補足図4b）。 SaClpP (PDB の 6TTY)、ADEP 4/SaClpP (PDB の 6TTZ)、(R)-ZG197/SaClpP (PDB の 7XBZ)、および (S)-ZG197/SaClpP (PDB の 7WGS) の構造アライメントにより、低い Cα 根平均が得られます。 ClpPモノマーの二乗偏差（RMSD）値は約0.2Åであり、ClpPフォールディングの高い類似性を示しています（補足図4c）43、46、47。 グローバルアクチベーターADEP 4と同様に、(R)-および(S)-ZG197結合はSaClpPの伸長状態を誘導し、これはα5ヘリックスの直線配向によって特徴づけられる26。 さらに、触媒トライアド（S98、H123、およびD172）も、これらの構造内で非常に類似した方向で表示されます（補足図4d）。 興味深いことに、(R)-および(S)-ZG197/SaClpP の構造複合体では 14 個の N 末端ループのうち 4 つまたは 5 つだけが順序付けられており、アクチベーター結合時のこれらのモチーフの高度に動的な性質を示唆しています。

SaClpP の疎水性部位における (R)-(a) と (S)-ZG197 (b) の相互作用の詳細図。 (R)-および (S)-ZG197 結合を示す fo-fc 省略マップは 3.0 Å で等高線が描かれ、緑色で色付けされています。一方、2fo-fc マップは、1.0 Å で等高線が描かれ、マゼンタで色付けされています。 (R)-ZG197はライトピンク、(S)-ZG197はライトブルーに着色されています。 水素結合は濃い破線で示され、距離はÅで表示されます。 c SaClpP複合体に結合した(R)-および(S)-ZG197と、疎水性ポケット内のHsClpPに結合したZG180の構造アラインメントの詳細図。 ZG180はシアン、(R)-ZG197はライトピンク、(S)-ZG197はライトブルーとなります。 SaClpP は灰色で色付けされ、HsClpP は小麦色で色付けされます。 d それぞれ（R）-ZG197、（S）-ZG197、およびONC212の存在下でのSaClpPI91W変異体によるα-カゼイン加水分解の定量。 e DSFアッセイで検出されたSaClpPI91Wタンパク質の熱安定性に対する活性化剤の影響。 f 相補された clpPI91W 変異株の無傷細胞における SaClpPI91W タンパク質の熱変性に対する 10 μM アクチベーターの効果を示す代表的なウェスタンブロット画像。 SaClpPI91W 発現は、1 ng/mL の無水テトラサイクリン (ATC) の存在下で誘導されました。 各実験について 3 つの生物学的複製を実行しました。 g HsClpPW146A変異体によるClpPアクチベーター促進のα-カゼインの加水分解の定量。 h DSF アッセイで検出された HsClpPW146A 変異体の熱安定性に対する活性化剤の影響。 i (c) の構造アラインメントを詳しく見ると、アクチベーターの結合と HsClpP の活性化に対する C 末端残基の影響が示されます。 j それぞれ HsClpPΔC (左) および HsClpPW146AΔC (右) 切断によるアクチベーター活性化α-カゼイン加水分解の効果の定量。 k DSF アッセイで検出された HsClpPΔC (左) および HsClpPW146AΔC (右) の熱安定性に対する活性化剤の影響 データ (d、e、g、h、j、および k) は 3 つの生物学的に独立した実験から得られ、平均値として表示されます。 ± SD (エラーバー)。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

(R)-および (S)-ZG197 が SaClpP に選択的に結合して活性化しますが、HsClpP は活性化しない構造メカニズムを理解するために、(R)-ZG197/SaClpP および (S)-ZG197/SaClpP の解明された構造を次のように並べました。 ZG180/HsClpP構造。 (S)-ZG197 のナフチル基は、ZG180 および (R)-ZG197 のナフチル基と比較して反対方向に位置しており、その結果、HsClpP の W146 の側鎖と直接衝突します。 これにより、(S)-ZG197がSaClpPと同様の様式でHsClpPに結合することが制限され得る(図4c)。 (R)-ZG197 のナフチル基は HsClpP の W146 の側鎖から離れた位置にありますが、(R)-ZG197 のメチル置換基は空間的な障害を生成し、HsClpP の W146 と衝突する可能性があり、これがその理由を説明している可能性があります (R) )-ZG197 は HsClpP と相互作用できません。 構造アラインメント分析は、SaClpP の I91 および HsClpP の W146 が、HsClpP ではなく、SaClpP に対する本発明のアクチベーターの選択的結合および活性化を担う主に重要な部位であることを示唆しています。

I91 が活性化因子の SaClpP への結合にどのような影響を与えるかを説明するために、HsClpP の対応する W146 を模倣するように SaClpP に I91W 変異体を構築し、(R)-および (S)-ZG197 が SaClpPI91W 変異体に結合して活性化するかどうかを決定しました。 予測どおり、(S)-ZG197 は SaClpPI91W 変異体に対してα-カゼイン加水分解活性の大幅な低下を示しますが、(R)-ZG197 および ONC212 は依然として SaClpPI91W を活性化して in vitro で α-カゼインを分解します（図 4d および補足図 4e）。 ）。 次に、DSF における ClpP 活性化因子と SaClpPI91W 変異体の間の相互作用を調査しました。 生化学的観察と一致して、（S）-ZG197はSaClpPI91W変異体を熱的に安定化できませんが、（R）-ZG197およびONC212は依然としてSaClpPI91W変異体のTmを大幅に増加させます（図4e）。 次に、(R)-ZG197 の SaClpPI91W への結合親和性を定量的に測定したところ、ITC アッセイにおける Kd は 0.93 ± 0.2 μM でした。 (S)-ZG197 と SaClpPI91W の間に結合は観察されませんでした (補足図 4f)。 (R)-ZG197 は SaClpPI91W 変異体に対して依然として陽性であることに注意してください。 これは、（R）-ZG197のメチル置換基がSaClpPI91W変異体ではW91との疎水性親和性に寄与する可能性があるためですが、HsClpPではW146と衝突する可能性があります（図4c）。 (R)-ZG197/SaClpPI91W複合体の構造が解明されれば、この現象のメカニズムを解明するのに有益と考えられる。 さらに、ΔclpP変異体でテトラサイクリン誘導性発現ベクターpYJ335を介して補完されたclpPI91W変異株を構築し（補足図4g）、補完された株におけるアクチベーターとSaClpPI91W変異体間の細胞相互作用を評価しました。 インビトロで観察された相互作用と一致して、(S)-ZG197処理は無傷のブドウ球菌細胞ではSaClpPI91WのTmシフトを誘導できませんが、(R)-ZG197とグローバルアクチベーターONC212はSaClpPI91Wの安定化に強い効果を示します（図4fおよび補足図4h）。

また、本発明者らは、本発明の活性化因子とW146の剛直な側鎖との間の立体衝突がHsClpPへのそれらの結合を制限するかどうかを試験するために、HsClpPW146A変異体を構築した。 (R)-ZG197がHsClpPに対して不活性であるという観察とは対照的に、(R)-ZG197はα-カゼイン加水分解に対するHsClpPW146A変異体を促進するために活性になり（図4gおよび補足図4i）、HsClpPW146Aに対する結合親和性を示します。 DSFアッセイで測定したとおり（図4h）。 ONC212 は常に in vitro で HsClpP と W146A 変異体の両方に結合し、活性化します。 しかし、(S)-ZG197 は HsClpPW146A に結合して活性化できないため、他の構造因子が (S)-ZG197 と HsClpP 変異体の相互作用を減弱させるという仮説を立てました。 以前は、HsClpP C 末端の余分なモチーフが ClpX シャペロンの結合を妨害することが示唆されていました 48。 特に、我々は、P248およびP249残基が、活性化因子のHsClpPの疎水性部位への接近および結合を妨げる可能性がある蓋モチーフを形成している可能性があることに気づいた（図4i）。 HsClpP のこの追加の蓋モチーフは、ハツカネズミ ClpP (MoClpP) やダニオ レリオ ClpP (DaClpP) などの他の真核生物の ClpP でも保存されています。 ただし、このC末端配列は短くなり、対応する蓋モチーフはSaClpPや大腸菌ClpP（EcClpP）などの細菌ClpPには存在しません（補足図2a）。

次に、C 末端切断 HsClpP (HsClpPΔC) および HsClpPW146A (HsClpPW146AΔC) タンパク質を精製し、2 つの切断に対するアクチベーターの効果を検出しました。 HsClpPW146Aに対する弱い効果と同様に、(S)-ZG197は依然としてin vitroでHsClpPΔCを最小限に活性化し、かろうじて安定化します（図4jおよびk、および補足図4j）。 ただし、(S)-ZG197は、α-カゼイン加水分解に対するHsClpPW146AΔC変異体を促進するように活性化し、DSFで測定した結合親和性を示します（図4jおよびk、および補足図4k）。これは、W146とC末端モチーフの共同作用を示しています。 HsClpPで。 興味深いことに、(R)-ZG197とONC212は両方とも、HsClpPW146AおよびHsClpPΔCと比較して、HsClpPW146AΔCへの結合および活性化能力の向上を示します（図4jおよびk、および補足図4k）。 まとめると、これは、疎水性ポケット内の 2 つの異なるアミノ酸 (SaClpP の I91 および HsClpP の W146) と HsClpP の追加の C 末端蓋モチーフが、私たちの種による HsClpP に対する SaClpP の選択的活性化を決定できる重要な因子であることを示しています。特定の活性化剤。

次に、液体培養で最小発育阻止濃度 (MIC) アッセイを実行し、黄色ブドウ球菌 8325-4 株に対する当社の活性化剤の抗菌効果を測定しました。 (R)-ZG197 は黄色ブドウ球菌を有意に抑制し、定量化された MIC は 0.5 μg/mL であり、ONC212 と同じくらい活性です (図 5a)。 (S)-ZG197 は黄色ブドウ球菌 8325-4 の増殖も阻害し、MIC は 4 μg/mL です。 (R)-ZG197 と (S)-ZG197 は両方とも、ヒット化合物 ICG-001 よりもブドウ球菌の増殖に対してはるかに優れた阻害効果を示します。 当社のアクチベーターの抗ブドウ球菌活性が黄色ブドウ球菌のClpPに依存するかどうかを詳しく調べるために、ΔclpP変異株および相補されたclpPまたはclpPI91W変異株に対する当社のアクチベーターの阻害効果をそれぞれ測定しました（図5a）。 選択的 (R)- および (S)-ZG197 アクチベーター、またはグローバル アクチベーター ICG-001 および ONC212 は、ΔclpP 変異株の増殖を最小限に抑制し、すべての MIC が 256 μg/mL を超えることが観察されます。 抗菌表現型は、ClpP 活性化因子の存在下で補完された clpP 株でレスキューすることができます。 (R)-ZG197、ICG-001、および ONC212 とは異なり、(S)-ZG197 はインビトロおよび細胞内で SaClpPI91W 変異体に対して不活性であるため、(S)-ZG197 の抗菌活性は相補された clpPI91W 変異株では大幅に減弱します。 これは、我々の活性化剤が黄色ブドウ球菌においてSaClpP依存的に抗菌活性を示したことを示している。

a MIC測定による、clpP、ΔclpP、および相補されたclpPまたはI91W変異体の遺伝的背景を有する黄色ブドウ球菌8325-4の増殖に対するClpP活性化因子の評価。 b ウェスタンブロットで検出された8325-4、ΔclpP、相補されたclpPおよびclpPI91W株の無傷細胞における細胞SaFtsZ存在量に対するSaClpPアクチベーターの影響の評価。 SaFtsZ のバンド強度の定量化は、SaGAPDH のローディング コントロールに対して正規化されており、DMSO グループの比は 1.0 と見なされます。 c clpP、ΔclpP、および相補型clpPまたはclpPI91Wの異なる遺伝的背景を有する黄色ブドウ球菌8325-4の細胞形態に対する(R)-および(S)-ZG197の影響を示すSEM顕微鏡写真の代表的な図。 スケールバーは 1 μm を表します。 d Newman株およびUSA300株の細胞分裂に対する20μMの(R)-および(S)-ZG197の影響を示すSEM顕微鏡写真の代表的な図。 スケールバーは 1 μm を表します。 e 黄色ブドウ球菌株のパネルの増殖に対するSaClpPアクチベーターのMICの測定。 (R)-および (S)-ZG197、ONC212、および臨床用抗生物質のオキサシリン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、ノルフロキサシン、クリンダマイシン、およびゲンタマイシンを同様の条件下でアッセイしました。 実験は三重に実施した。 f 定常期 USA300 の根絶に対する (R)-および (S)-ZG197 併用療法の殺菌効果 (n = 3 生物学的に独立した実験)。 細胞数はCFU/mLで記録した。 データは平均値 ± SD として表示されます。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

細胞分裂タンパク質 SaFtsZ は、細胞内の活性化因子の存在下で SaClpP が異常に活性化されると過剰分解される可能性があります 25。 実際、(R)-ZG197、(S)-ZG197、および ONC212 を含むすべての活性化因子は、イムノブロッティング アッセイで検出されたように、8325-4 黄色ブドウ球菌における SaFtsZ 存在量を減少させますが、対応する ΔclpP 変異株では減少させません (図 2)。 5b)。 SaFtsZ の存在量は、選択的アクチベーター (R)-ZG197 またはグローバル アクティベーター ONC212 の存在下で、相補された clpP または clpPI91W 変異体で劇的に減少します。 (S)-ZG197 が SaClpPI91W 変異体プロテアーゼ活性を活性化できないという観察と同様に、(S)-ZG197 の存在下で相補された clpPI91W 株における SaFtsZ の存在量の明らかな減少は観察されませんでした。 これは、我々の活性化因子が、細胞のSaClpPに高度に依存する黄色ブドウ球菌におけるSaFtsZの異常な分解を誘導したことを示している。

SaFtsZ の分解調節異常は、黄色ブドウ球菌の細胞分裂を損なう可能性があります 24,25。 次に、走査型電子顕微鏡 (SEM) を使用してブドウ球菌細胞の細胞形態を測定しました。これは、ブドウ球菌の細胞分裂に対する当社の活性化因子の阻害効果を反映している可能性があります 49。 ブドウ球菌細胞の直径は、溶媒グループの8325-4、ΔclpP、および補完されたclpPまたはclpPI91W株の平均でそれぞれ0.64μm、0.69μm、0.73μm、0.75μmと測定されます（図5cおよび補足図5a）。 。 興味深いことに、ブドウ球菌細胞分裂に対する FtsZ 阻害剤 TXA709 の阻害効果と同様に、(R)-および (S)-ZG197 処理により 8325-4 および相補 clpP 株の細胞直径が大幅に拡大し、測定直径は通常 1.00 より大きくなります。 μm50。 当社の活性化剤で処理した細菌では、ブドウ球菌細胞形態の縮小、溶解、および完全な分解が観察されました。 対照的に、ΔclpP 変異体を (R)-および (S)-ZG197 活性化因子に曝露した場合、細菌の直径や細胞形態の変化は観察されませんでした。 (R)-ZG197 で処理すると、補完された clpPI91W 変異株の細胞サイズが拡大しますが、(S)-ZG197 はこの株の細菌の直径に影響を与えません。 また、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌株の臨床分離株である Newman と、代表的な MRSA 分離株である USA300 での細胞分裂に対する選択的活性化因子の効果もテストしました (補足表 2)。 Newman 細胞と USA300 細胞の直径が拡大する同様の現象が、(R)-および (S)-ZG197 の存在下で観察されました (図 5d、補足図 5b、c)。 我々は、(R)-および(S)-ZG197が、細胞のSaClpPに依存する黄色ブドウ球菌の細胞分裂に対して抑制効果を示すことを実証した。

当社の種特異的活性化因子が黄色ブドウ球菌 8325-4 の増殖を抑制することを考慮して、次に、ニューマン株や多剤耐性黄色ブドウ球菌株を含む一連の黄色ブドウ球菌株に対する (R)-および (S)-ZG197 の抗ブドウ球菌スペクトルをテストしました。耐性のあるMRSA株。 USA300、NRS-1、NRS-70、NRS-100、NRS-108、NRS-271 MRSA 株は、黄色ブドウ球菌の抗菌耐性ネットワークから収集されました (補足表 2)。 (R)-ZG197 は、これらの黄色ブドウ球菌株の広範囲に対して MIC 値 0.5 ～ 2 μg/mL の強力な抗菌活性を示しますが、(S)-ZG197 は 2 ～ 2 μg/mL の中程度の MIC 値でこれらの株の増殖を抑制します。 8 μg/mL (図 5e、左パネル)。 また、XJ009、XJ036、XJ049、XJ051、および XJ052 を含む中国の 5 つの病院で取得された多剤耐性 MRSA 分離株に対する当社の活性化剤の抗菌効果もテストしました (補足表 2)。 これらの臨床 MRSA 分離株は、オキサシリン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、ノルフロキサシン、クリンダマイシン、ゲンタマイシンを含むいくつかの臨床抗生物質に対して顕著な耐性を示していますが、これらはすべて、(R)- の MIC 値が 0.5 ～ 1 μg/mL の当社の活性化剤に対して感受性があります。 ZG197 および (S)-ZG197 の場合はそれぞれ 2〜8 μg/mL (図 5e、右パネル)。 グローバルアクチベーター ONC212 も、これらの菌株では低い MIC 値を示します。

ONC212 およびバンコマイシンと同様に、(R)-ZG197 と (S)-ZG197 は両方とも、指数関数的に増殖するニューマン株に対して優れた殺菌効果を示します (補足図 5d)。 次に、抗生物質の持続性を引き起こすために急性ストレスにさらされる細胞である持続菌の根絶に対する、当社のアクティベーターの抗菌効果を評価しました51。 栄養制限に苦しんだ一晩定常期の黄色ブドウ球菌細胞のコホートは持続型であり、従来の抗生物質で根絶するのは困難でした52。 十分に確立されたClpP活性化因子ADEPと同様に、(R)-ZG197、(S)-ZG197、リファンピシン、およびシプロフロキサシンはそれぞれ単独で、USA300培養物のMRSA株のコロニー形成単位(CFU)を最小限に減少させます(図5fおよび補足)図5e）、（R）-ZG197または（S）-ZG197とリファンピシンまたはシプロフロキサシンのいずれかを使用する併用療法は、USA300持続者の数を検出限界まで大幅に減少させます（図5f）。 持続性黄色ブドウ球菌細胞に対する併用療法の抑制効果をさらに調査するために、USA300 株に対して二相殺傷アッセイを実施しました。 ADEP 423 と同様に、リファンピシンやシプロフロキサシンなどの 2 つ目の従来の抗生物質を追加すると、シプロフロキサシン誘導性持続菌の増殖がわずかに損なわれる一方、(R)-および (S)-ZG197 SaClpP 活性化因子の存在により持続菌が完全に根絶されることがわかりました。検出限界（補足図5f）。 まとめると、これらの結果は、当社の活性化剤が従来の抗生物質と組み合わせた場合、ADEP 4 と同じくらい効率的にブドウ球菌の持続菌を根絶することを証明しています。

また、種特異的活性化因子によって誘導される SaClpP の耐性変異体もスクリーニングしました。 耐性率は確立されたプロトコルに従って定義されます47。 (R)-ZG197 および (S)-ZG197 の 4 × MIC によって誘発される自発的耐性の頻度は 10-7 の範囲にあり、これは ClpP の全体的な活性化因子である ADEP 4 および ONC212 と同等です。 すべての変異部位はランダムに分布し、ClpP の疎水性結合ポケットの外側に位置します (補足表 3)。

当社の活性化因子の抗感染症効果を in vivo でテストするために、まずその生物活性プロファイルを評価しました。 最初に Wnt/β-カテニン阻害剤として同定されたスクリーニング ヒット化合物 ICG-001 とは異なり、(R)-および (S)-ZG197 は、HEK 293T/17 および HK-2 における Wnt/β-カテニン シグナル伝達経路の破壊を最小限に抑えます。 Wnt/β-カテニンルシフェラーゼレポーターアッセイにおける細胞株（補足図6a）39。 次に、MTT アッセイで HEK 293T/17 および HK-2 細胞株の生存率に対する SaClpP アクチベーターの効果を調査しました。 予想どおり、(R)-および(S)-ZG197は、高いIC50値を伴う低い阻害活性によって証明されるように、哺乳動物細胞の増殖に対する毒性影響を最小限に抑えます（補足図6b）。 対照的に、グローバルアクチベーター ONC212 と当社のヒット化合物 ICG-001 は、哺乳動物細胞の生存率を劇的に阻害します。特に ONC212 は 20 ～ 60 nM という低い IC50 値を示します。 また、ゼブラフィッシュに対するアクティベーターの細胞毒性効果も評価しました。 (R)-または(S)-ZG197を25または50 mg/kgの単回投与で投与しても、ゼブラフィッシュの生存に細胞毒性効果はありません（補足図6c）。 100 mg / kgで投与すると、ONC212はゼブラフィッシュの死を著しく引き起こしますが、(R)-または(S)-ZG197はゼブラフィッシュに対して依然として安全です（補足図6c）。 これは、生体内での抗ブドウ球菌感染症に対する種特異的活性化因子の生物学的安全性を示しています。

次に、ゼブラフィッシュ感染モデルを使用して、ZG197 の in vivo 抗菌効果を評価しました。このモデルは、黄色ブドウ球菌感染症に対する抗ブドウ球菌薬を評価するために広く使用されている in vivo モデルです 53。 まず、妥当な時間枠内でゼブラフィッシュの死亡率につながる可能性がある黄色ブドウ球菌の適切なCFUを決定しました（補足図6d）。 ブドウ球菌感染後の5日間のゼブラフィッシュの生存率を測定することにより、SaClpPアクチベーターの抗菌力を評価しました（補足図6e）。 50 mg/kg の (R)-および (S)-ZG197 の単回投与は、USA300 に感染したゼブラフィッシュの生存率を有意に延長します (図 6a)。 25 mg / kgのより低い用量の（R）-または（S）-ZG197も、USA300誘発性致死感染からゼブラフィッシュを効果的に保護します（補足図6f）。 同様に、25 mg / kgまたは50 mg / kgの（R）-ZG197の投与は、ニューマン感染ゼブラフィッシュの生存率を効果的に改善し、ONC212よりも生存率が優れています（補足図6gおよび図6b）。 しかし、(R)-ZG197はΔclpP変異株に感染したゼブラフィッシュに対して治療効果を失うが、バンコマイシンは依然としてこの感染に対して活性を有する(図6c)。 これは、感染ゼブラフィッシュに対する (R)-ZG197 の有望な抗ブドウ球菌効果が in vivo で SaClpP に依存していることを示しています。 50 mg/kg の (R)-ZG197 を単回投与すると、臨床 MRSA 株 XJ049 に感染したゼブラフィッシュに対して顕著な治療効果が得られます。 対照的に、この株は臨床的に使用される抗生物質オキサシリンおよびエリスロマイシンの治療に対して耐性があります（図6d）。 50 mg / kgのグローバルアクチベーターONC212が、おそらくDaClpPを標的とすることによる細胞毒性副作用のため、MRSA XJ049に感染したゼブラフィッシュの生存率を延長できないことは驚くべきことではありません（図6d）。

a ゼブラフィッシュにおける USA300 感染に対する (R)-および (S)-ZG197 の治療効果。 ゼブラフィッシュ (n = 11 匹) に 7 × 106 CFU の USA300 を感染させ、化合物を 50 mg/kg の単回投与で投与しました。 DMSO (5%) およびバンコマイシンを対照として投与した。 Newman (b) および ΔclpP 変異体 (c) による致死感染に対する (R)-ZG197 の治療効果。 ゼブラフィッシュ (n = 11 匹) に 7 × 107 CFU の Newman (b) または 3 × 107 CFU の ΔclpP 変異体 (c) を感染させ、化合物を感染ゼブラフィッシュに 50 mg/kg で投与しました。 バンコマイシンおよびONC212を対照として使用した。 d 臨床MRSA分離株感染ゼブラフィッシュに対する(R)-ZG197の治療効果。 ゼブラフィッシュ (n = 11 匹) に 5 × 107 CFU の XJ049 を感染させ、化合物を 50 mg/kg の単回投与量で投与しました。 DMSO (5%)、抗生物質 (バンコマイシン、エリスロマイシン、オキサシリン)、およびグローバル アクチベーター ONC212 をコントロールとして使用しました。 e 初期（左パネル）および感染後4日（右パネル）の壊死性皮膚病変サイズの定量。 バンコマイシンを陽性対照として使用した。 データは平均値 ± SD (n = 9 匹) として示されています。 f 感染後 4 日目の壊死性皮膚病変を示す代表的な画像。 スケールバーは 1 cm を表します。 g 皮膚サンプル中の細菌数に対する当社の活性化剤の影響 (n = 8 生物学的に独立したサンプル)。 感染後4日目にUSA300に感染したマウスから皮膚組織を切除し、TSA上にプレーティングしてCFUを数えた。 h 示された治療後の H&E 染色された皮膚組織の顕微鏡写真。 スケール バーは 1 mm (上) と 0.1 mm (下) を表します。 統計的差異は、ログランク検定 (a ～ d) および対応のない両側スチューデント t 検定 (e、g) を使用して分析されました。 正確な P 値が提供されます。 ns、意味はありません。 データ (e、g) は平均値 ± SD (エラーバー) として表示されます。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

最後に、我々は、マウス皮膚黄​​色ブドウ球菌感染モデルにおける当社の活性化剤の生体内抗感染効果を評価しました54。 マウスの皮膚に 2.5 × 106 CFU の USA300 を接種したところ、16 時間後に病変が現れました。 各グループの初期病変面積は同等です（図6e）。 (R)-および(S)-ZG197を7.5mg/kgで1日2回皮下注射すると、ビヒクル対照と比較してマウスの壊死病変サイズが小さくなります(図6e、f)。 さらに、（R）-および（S）-ZG197で治療したマウスの病変を切除した場合、ビヒクル対照と比較して細菌量の有意な減少が観察されました（図6g）。 ヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色を使用した組織学的分析でも、当社の活性化剤またはバンコマイシンで処理すると、皮膚組織の壊死領域と炎症性浸潤の減少が示されますが、ビヒクル処理サンプルでは高密度の炎症性浸潤が表示されます（図6h）。 総合すると、当社の活性化剤は、in vivo での多剤耐性 MRSA 感染症に対する有望な抗生物質であるが、細胞毒性効果は最小限であると特定されています。

細菌のClpPプロテアーゼの異常活性化は、抗生物質耐性のあるグラム陽性菌による院内感染を治療する有望な方法である。 所望のＳａＣｌｐＰ活性化剤は、宿主ＣｌｐＰの適切な機能を妨害するのではなく、ブドウ球菌ＣｌｐＰを標的とすることが好ましい。 しかし、これまでの研究では、ADEP 類似体や ONC212 など、複数の種の ClpP プロテアーゼに対するいくつかの包括的な活性化因子が同定されており、これらは必然的に意図しないオフターゲット効果を生み出し、抗 MRSA 感染症の創薬への応用を妨げる可能性があります。 したがって、SaClpP を選択的に活性化する別個の化学足場を同定することは、化学活性化戦略を使用した MRSA 感染症に対するその抗感染症治療の可能性を強調することになります。

我々は、ClpP プロテアーゼ活性を促進する化合物に HTS を使用し、N-ベンジルおよびナフタレン-1-イルメチル二置換ペプチド模倣化合物 (ICG-001) を SaClpP と HsClpP の両方に対して中程度の活性を持つ活性化剤として同定するための実験的検証を行います。 ICG-001 類似体の合成最適化により、(6S,9aS)-6-((S)-sec-ブチル)-8-(ナフタレン-1-イルメチル)-4,7-ジオキソ-N-(4, 4,4-トリフルオロブチル)ヘキサヒドロ-2H-ピラジノ[1,2-a]ピリミジン-1(6H)-カルボキサミド (ZG180) は、両方のプロテアーゼに対する活性が大幅に向上しました。 ZG180 にメチル置換基を組み込むことにより、(R)-および (S)-ZG197 は HsClpP よりも SaClpP に対して最も強力で選択性の高い活性化剤になります。 当社の活性化剤は、細胞内の SaFtsZ タンパク質の異常な分解を増加させ、ブドウ球菌の細胞分裂を阻害し、in vivo での黄色ブドウ球菌菌血症の致死的転帰の防止において顕著な抗生物質の有効性を示します。 以前の研究では、ICG-001がWnt/β-カテニンシグナル伝達経路の阻害剤として実証され、異種移植されたマウスモデルにおいて抗増殖効果を発揮した。 それにもかかわらず、当社の活性化剤は哺乳動物細胞株の生存率を最小限に阻害するため、抗生物質の臨床開発中にさらに調査する必要があります。

SaClpP の種特異的活性化因子として (R)-および (S)-ZG197 を同定したことにより、特定の ClpP の選択的結合および特異的化学活性化の発達に関する構造的洞察が得られます。 HsClpP の嵩高い W146 は、(S)-ZG197 活性化因子の障害となるナフチル置換基との好ましくない立体衝突を引き起こし、そのためリガンドの HsClpP への結合を妨げます。 これは、W146/I91 残基が活性剤の種選択性を部分的に決定する重要な要素であることを示しています。 HsClpP の W146 がアクチベーター識別の臨界点を表すという観察に加えて、我々の研究は、(S)-ZG197 の活性の回復と活性の改善によって証明されるように、W146 と HsClpP の C 末端モチーフとの共同作用も明らかにしています。 HsClpPW146AΔCの結合および活性化に対する(R)-ZG197を、HsClpPW146A変異体またはHsClpPΔC切断型のいずれかと比較した。 これまでに発表された研究と合わせて、この研究は、疎水性ポケットの空間的な違いや他のアミノ酸の配位などの重要な構造因子が、ClpP 活性化因子の識別に大きく寄与していることを示しています。 さらに、変異体アクチベーターは、細菌およびミトコンドリアの ClpP タンパク質に対して異なる反応を示します。

細菌のClpPの化学活性化は、細菌のClpPを制御不可能な状態に効率的に切り替えて、細菌にとって重要な多数の基質の過剰な分解を引き起こし、最終的に病原性細菌を破壊します。 我々は、(R)-ZG197 と (S)-ZG197 の両方が HsClpP よりも SaClpP に選択的に結合し、FtsZ などの必須タンパク質の非選択的加水分解のために、アクチベーターに結合した SaClpP を完全に拡張された活性構造で誘導することを実証します。 細菌のClpPは生存に必須ではありませんが、ClpP活性化因子はClpP変異を誘導する傾向があり、その結果耐性が生じます。 したがって、併用療法は、SaClpP 活性化因子の治療適用に最適な方法である可能性が高く、標的ベースの耐性を低下させ、抗生物質のスペクトルを広げ、投与量と望ましくない副作用を軽減できる可能性があります。 また、(R)-ZG197 または (S)-ZG197 をリファンピンまたはシプロフロキサシンと組み合わせて使用​​すると、持続菌の集団が検出レベルまで劇的に根絶されることも示します。

複数の種間で高度に保存された ClpP プロテアーゼを考えると、特にグラム陰性菌や腸内細菌叢の場合、我々のアクチベーターが異なる種の他の ClpP プロテアーゼを同様に機能獲得状態に切り替えることができるかどうかを調査する必要があります。 MRSA感染症を治療するために種特異的SaClpP活性化因子の抗菌能力を向上させるには、さらなる合成の最適化が必要です。 追加の in vivo 動物感染モデルに対する本発明のアクチベーターの抗感染効果を評価することにより、これらのアクチベーターの抗菌力を完全に特徴付けることができます。

結論として、我々は、(R)-および(S)-ZG197を選択的SaClpP活性化因子として報告し、HsClpPではなくSaClpPを選択的に促進するための重要な残基/モチーフを同定する。 私たちのデータは、ClpP プロテアーゼの化学活性化に関する機構的な洞察を提供し、ブドウ球菌プロテアーゼの機能を選択的に妨害できる種特異的な抗生物質の発見を加速します。 この研究は、MRSA感染症を治療するための有望な戦略を示唆する可能性があり、宿主に対する細胞毒性を最小限に抑えた強力な合成抗生物質足場の生成に貢献します。

野生型ゼブラフィッシュ (生後 7 ～ 11 か月、性別に関係なく、300 ± 50 mg) を小関水族館 (中国、上海) から購入し、定期的に餌を与えながら周囲温度の 10 L 水槽で維持しました。 同様のサイズおよびランダムな性分布のゼブラフィッシュを黄色ブドウ球菌感染に使用しました。 メスの BALB/c マウス (6 ～ 8 週齢、18 ～ 20 g) を Zhejiang Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. から購入しました。すべてのマウスは、上海公営の特定病原体除去施設で自由食で飼育されました。健康臨床センター。 暗/明サイクル 12 時間、周囲温度 20 ～ 26 °C、湿度 40 ～ 60% の飼育条件をマウスに適用しました。

SaClpP (1:5,000、カタログ番号 C11185)、SaFtsZ (1:5,000、カタログ番号 C11186)、および SaGAPDH (1:5,000、カタログ番号 C1399) の抗体は、精製タンパク質を抗原として使用して Shanghai Immune Biotech Ltd によって生成されました。 ELISA実験によって検証されました。 HsClpP の抗体 (1:2,000、Clo#EPR7133、Cat#ab124822、Lot#GR3210822-8、Abcam)、β-アクチン (1:5,000、Clo#2D4H5、Cat#66009-1-Ig、Lot#10004156、Proteintech) ）、HRP 結合ヤギ抗ウサギ IgG (1:10,000、カタログ番号 CW0103、Cwbio)、および HRP 結合ヤギ抗マウス IgG (1:10,000、カタログ番号 CW0102、Cwbio) は市販されています。

この研究で使用した細菌株を補足表2に示します。トリプトン大豆ブロス（TSB、OXOID）、トリプトン大豆寒天培地（TSA、OXOID）、ブライアンハートインフュージョン（BHI、OXOID）、ミュラーヒントン寒天培地（MHA、黄色ブドウ球菌の培養には、Dalian Meil​​un Biotech）およびMueller-Hinton Broth（MHB、Dalian Meil​​un Biotech）培地を使用しました。 大腸菌（E. coli）の増殖には、ブロスまたは LB 寒天培地中のルリア ベルターニ (LB) を使用しました。

ZG180、(R)-ZG197、および (S)-ZG197 は研究室で合成され、完全に特性評価されました。 ONC212 と ADEP 4 は、それぞれ Topscience と ChemPartner (中国、上海) から購入しました。 バンコマイシン、スペクチノマイシン、エリスロマイシン、シプロフロキサシン、リファンピシン、テトラサイクリン、ノルフロキサシン、クリンダマイシン、およびゲンタマイシンの抗生物質は、Dalian Meil​​un Biotech から購入しました。 オキサシリンは Sigma-Aldrich から購入しました。 無水テトラサイクリン (ATC) は APExBIO から購入しました。

HEK 293T/17 (CRL-11268) および HK-2 (CRL-2190) 細胞株は、American Type Culture Collection (ATCC) から購入しました。 細胞は、10％ウシ胎児血清（FBS、GIBCO）および1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Corning）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Corning）中で培養した。 細胞は、加湿された 5% CO2 含有雰囲気インキュベーター (Thermo Scientific) 内で 37 °C で培養されました。 すべての細胞はショート タンデム リピート (STR) プロファイリングによって検証されており、マイコプラズマが存在しないことが定期的にチェックされています。

SaClpP の発現にはプラスミド pET28b-SaClpP を使用しました 49。 大腸菌BL21(DE3)Gold株を、30μg/mLカナマイシンの存在下でプラスミドで形質転換した。 OD600 (波長 600 nm での吸光度) が 0.6 ～ 0.8 に達すると、0.5 mM イソプロピル β-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG) により 30 °C で 4 時間、タンパク質発現が誘導されました。 次に、細胞ペレットを収集し、-80 °C で保存しました。 細胞を溶解し、上清を結合緩衝液（50 mM Tris-HCl、pH 8.0、100 mM NaCl、および50 mM イミダゾール）中の5 mL HisTrapTM HP（GE Healthcare）カラムに供し、その後、溶出緩衝液（50 mM）で溶出した。トリス-HCl、pH 8.0、100 mM NaCl、および 400 mM イミダゾール)。 溶出したタンパク質をカットオフ 10 kDa の Amicon Ultra Centrifugal Filters (Merck-Millipore) で濃縮し、HiLoad 16/60 Superdex 200 カラム (GE Healthcare) を備えた AKTA 精製システムで 20 mM HEPES、pH 7.0 中でゲル濾過を行いました。 100mM NaCl。 SaClpPI91W の部位特異的変異は、Quikchang 部位特異的変異誘発キット (Stratagene) に従って確立されました。 同様の手順を SaClpPI91W 精製に適用しました。

プラスミド pET28a-SaFtsZ を SaFtsZ 発現に使用し 49、30 μg/mL カナマイシンの存在下で大腸菌 BL21 (DE3) Gold に形質転換しました。 OD600 が 0.6 に達すると、SaFtsZ の発現が 0.5 mM IPTG によって 16 °C で 12 時間誘導されました。 次に、細胞ペレットを溶解し、上清を結合バッファー (50 mM Tris-HCl、pH 8.0、200 mM NaCl、および 50 mM イミダゾール) 中で 5 mL HisTrapTM HP カラムと結合させ、次に溶出バッファー (50 mM Tris) で溶出しました。 -HCl、pH 8.0、200 mM NaCl、および 400 mM イミダゾール)。 溶出したタンパク質は、10 kDa カットオフの Amicon Ultra Centrifugal Filters (Merck-Millipore) で濃縮し、-80 °C で保存しました。

HsClpP 発現のために、pPSUMO-CLPPΔN56 プラスミドを大腸菌ロゼッタ (DE3) 細胞に形質転換しました 40。 OD600が0.6〜0.8に達するまで細胞を37℃で培養し、0.5mM IPTGにより37℃で4時間HsClpPの発現を誘導した。 細胞を結合緩衝液(20 mM Tris-HCl、pH 7.5、500 mM NaCl、10 mM イミダゾール、および10% グリセロール)中で溶解した。 次いで、上清を５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＨＰカラムに通した。 結合緩衝液で洗浄した後、標的タンパク質を溶出緩衝液（20 mM Tris-HCl、pH 7.5、500 mM NaCl、500 mM イミダゾール、および10% グリセロール）で溶出した。 次いで、収集したタンパク質を濃縮し、結合緩衝液に再懸濁した。 次に、ULP1 プロテアーゼを添加して、N 末端 His-SUMO タグを 4 °C で一晩穏やかに振盪しながら切断しました。 次に、残りの画分を HisTrapTM HP カラムに通して、His-SUMO タグおよび His タグ付き ULP1 を除去しました。 さらなる精製を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、および５％グリセロール中でＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムを通して行った。 HsClpPW146A、HsClpPΔC、およびHsClpPW146AΔCのプラスミドの構築は、Quikchang部位特異的突然変異誘発キットに従って実施した。 HsClpPW146A、HsClpPΔC、およびHsClpPW146AΔCの精製は、HsClpPの精製と同様でした。 タンパク質は、30% グリセロール中で -80 °C で保存されました。

変異体用のプラスミド構築に使用したプライマー配列を以下に示します。

SaclpPI91W-F: GATGTTCAAACATGGTGTATCGGTATGGC

SaclpPI91W-R: GCCATACCGATACACCATGTTTGAACATC

HsCLPPW146A-F: CCGATTTGTACCGCCTGTGTGGGTC

HsCLPPW146A-R: GACCCACACAGGCGGTACAAATCGG

HsCLPPΔC-F: GTGCTGGTTCATTAGCCGCAGGATGGTGAAGATG

HsCLPPΔC-R: CATCTTCACCATCCTGCGGCTAATGAACCAGCAC

10 マイクログラムの SaClpP、SaClpPI91W、HsClpP または HsClpPW146A を、25 mM HEPES-KOH (pH 7.6)、200 mM KCl、5 mM MgCl2、1 mM EDTA、10% (v/v) グリセロール、および 2 mM を含む 50 μL 緩衝液に溶解しました。一方、10μgのHsClpPΔCまたはHsClpPW146AΔCを、25mM HEPES-KOH（pH7.6）、5mM MgCl2、5mM KCl、0.03％Tween-20、10％グリセロール、および2mM DTTを含む50μL緩衝液に溶解した。 様々な濃度の化合物(DMSOの最終濃度1%)を室温で15分間プレインキュベートした。 次に、0.72 mg/mL α-カゼインを添加し、37 °C で 2 時間反応させました。 サンプルを SDS ローディングバッファーと混合し、12% SDS-PAGE とそれに続くクーマシー ブリリアント ブルー R-250 染色によって分析しました。 EC50 値は、3 つの生物学的複製から GraphPad Prism 8 によって計算されました。

PD バッファー (25 mM HEPES-KOH (pH 7.6)、200 mM KCl、5 mM MgCl2、1 mM EDTA、10% (v/v) グリセロール、および 2 mM DTT) 中のテトラデカマー SaClpP タンパク質 (0.6 μM) および化合物(40μM)を黒色の平底384ウェルプレートに加えた。 37℃で30分間インキュベートした後、蛍光標識基質FITC-カゼイン（0.048 mg/mL）（Sigma）を添加し、37℃で加水分解反応を開始した。 2 時間後、マイクロプレート リーダー (TECAN) を使用して、蛍光シグナルを励起波長 485 nm、発光波長 535 nm で記録しました。

ZG180 および (R)-ZG197 と (S)-ZG197 はこの研究室で合成され、合成方法とその特徴付けは補足方法および補足図 7–23 に記載されています。

SaClpP および HsClpP タンパク質は、16 °C でのシッティングドロップ蒸気拡散法によって結晶化されました。 10 mg/mL タンパク質のサンプルを 5 倍濃度の ZG180、(R)-または (S)-ZG197 の化合物 (5% DMSO を含む) と混合し、4 °C で 30 分間インキュベートしました。 滴下には、1 または 2 μL の SaClpP サンプルと、30%(v/v) 2-メチル-2,4-ペンタンジオール、0.1 M 酢酸ナトリウム/HCl (pH 8.0)、20 mM 塩化カルシウムの存在下での 1 μL リザーバー溶液が含まれていました。のZG180、または(R )-および(S)-ZG197。 10 mg/mL の HsClpP サンプルを、5 倍濃度の ZG180 の存在下、氷上で 30 分間インキュベートし、20% w/v ポリエチレングリコール 3350、0.2 M マロン酸ナトリウム (pH 5.0) のリザーバー溶液と混合しました。 これらの結晶は1週間から1か月以上後に成長しました。 次に、結晶を採取し、20% (v/v) グリセロールに 30 秒間浸し、その後液体窒素に保存しました。

ZG180/SaClpP および (R)-ZG197/SaClpP の回折データは、上海シンクロトロン放射施設 (SSRF) ビームライン BL19U155 の Bluice を介して収集されました。 X 線データは、HKL2000 プログラム スイートを介して処理されました。 ZG180/HsClpP または (S)-ZG197/SaClpP の回折データは、SSRF ビームライン BL02U1 の Finback を介して収集され、Aquarium56 によって自動的に処理されました。 構造は、検索モデルとして SaClpP (PDB コード 3STA) および HsClpP (PDB コード 1TG6) を使用して解決され、モデルは COOT43、48、57 で構築されました。 最後に、データはプログラム REFMAC558 で改良されました。 自由な反射が自動的に選択され、すべての調整に適用されました。 構造アラインメントは PyMOL59 で実行されました。

SaFtsZ 分解を in vitro の SDS-PAGE で分析しました。 簡単に言うと、10μgのSaClpPを50μLのPD緩衝液に溶解した。 様々な濃度の化合物(DMSOの最終濃度1%)を添加した後、混合物を室温で15分間インキュベートした。 その後、SaFtsZ (1.5 μM) を添加し、37 °C で 2 時間反応させました。 サンプルを SDS ローディングバッファーと混合し、12% SDS-PAGE とそれに続くクーマシー ブリリアント ブルー R-250 染色によって分析しました。 EC50 値は、3 つの生物学的複製から GraphPad Prism 8 によって計算されました。

8325-4/ΔclpP 株の細胞溶解物は、SaFtsZ 分解アッセイにも使用されました。 8325-4/ΔclpP の一晩ブドウ球菌培養物を 1:500 に希釈し、37 °C で指数関数期初期から中期 (OD600 = 0.4 ～ 0.6) まで培養しました。 次いで、培養物をＰＤ緩衝液で３回洗浄し、続いて０．７５Ｕのリソスタフィン（Ｓｉｇｍａ）を使用して細胞を溶解した。 次に、細胞溶解物を 12,396 × g で遠心分離し、上清を収集して 50 μL に分割しました。 9 マイクロモルのウシ血清アルブミン (BSA、Dalian Meil​​un Biotech)、SaClpP または HsClpP タンパク質、およびさまざまな濃度の化合物をシステムに追加しました。 37℃で2時間インキュベートした後、サンプルをSDSローディングバッファーと混合し、100℃で10分間加熱しました。 次に、細胞の SaFtsZ 量を検出するためにサンプルを SDS-PAGE にロードしました。 タンパク質をニトロセルロース膜 (Millipore) に移し、5% スキムミルクを含む TBST で室温で 1 時間ブロックし、続いて SaFtsZ (1:5,000) および SaGAPDH (1:5,000) の一次抗体と 4 °C でインキュベートしました。 C一晩。 TBSTで洗浄した後、ウエスタンブロット分析のためにHRP標識ヤギ抗ウサギIgG(1:10,000)を加えました。

SaClpP または SaClpPI91W タンパク質を 100 mM HEPES、pH 7.0、100 mM NaCl に最終濃度 2 μM (単量体濃度) になるまで溶解し、HsClpP、HsClpPΔC、HsClpPW146A または HsClpPW146AΔC を 20 mM Tris-HCl を含むアッセイバッファーに溶解しました。 、ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、および最終濃度２μＭ（単量体濃度）までの５％グリセロール。 様々な濃度の化合物(1% DMSOを含む)をアッセイ緩​​衝液に加えた。 室温で 10 分間インキュベートした後、5 × SYPRO Orange 色素 (Invitrogen) を各サンプルに添加しました。 検出は、CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) で励起波長 492 nm、発光波長 610 nm で記録されました。 サンプルを 1 °C/分の速度で 25 °C から 95 °C まで加熱しました。 データ分析は、Bio-Rad CFX Manager ソフトウェアおよび GraphPad Prism 8 を使用して実行されました。化合物処理グループのタンパク質の Tm を、DMSO グループのタンパク質の Tm と比較して参照しました。

ITC 実験は、報告された方法 44,60 に従って、MicroCal iTC200 システム (GE Healthcare) 上で 20 mM HEPES、100 mM NaCl、pH 7.0、5% DMSO を含む緩衝液中、25 °C で 750 rpm で一定に撹拌しながら実施されました。 タンパク質と化合物はまったく同じ緩衝液に溶解されました。 セルには50μMの(R)-または(S)-ZG197を充填し、シリンジには500μMのSaClpPI91Wまたは700μMのSaClpPを充填した。 システムの自動平衡化後、シリンジ内の 2 μL 溶液がセルに注入されて結合反応が引き起こされ、記録されたシグナルに特徴的なピーク シーケンスが生成されました。 ベースライン補正と評価を含むデータ分析は、OriginPro 8.5 ITC を使用して実行されました。 最初の注入を除くすべての注入を考慮してフィッティングを実行し、最大熱と平衡解離定数 (Kd) の値を計算しました。

この実験は Octet RED96 (ForteBio) を使用して実行されました。 SaClpP および HsClpP タンパク質を PBS 緩衝液中で室温で 1 時間ビオチン化しました。 次に、PD MiniTrap™ G-25 Desalting Column (cytiva) を使用してビオチン化タンパク質を収集しました。 ストレプトアビジンバイオセンサーを、0.5% DMSOを含むPBST (0.5% Tween-20を含むPBS)中で10分間インキュベートし、続いて50μg/mLのビオチン化SaClpPまたはHsClpPをロードした。 参照対照には、0.5% DMSO を含む PBST 中でのみインキュベートされたセンサーの重複セットを適用しました。 さまざまな濃度の (R)-および (S)-ZG197 を使用して結合曲線を計算しました。 検出は、96 ウェル黒色プレートを使用し、総量 200 μL、30 °C で標準プロトコールを使用して実行されました。 BLI データは、Octet Acquisition 11.0 を使用して収集されました。 Octet Analysis 11.0 を使用して結合速度論を計算するために、二重参照サブトラクション プロトコルによってシグナルを分析しました。 Kd 値は定常静的フィット曲線から計算されました。

黄色ブドウ球菌におけるSaClpPの構成的発現のためのプラスミドを構築するために、clpP遺伝子およびその上流29塩基対をカバーするDNA断片を黄色ブドウ球菌8325-4ゲノムDNAから増幅し、pYJ335にクローニングした。 SaclpPI91W 変異体は、プライマー SaclpPI91W-F および SaclpPI91W-R を使用した QuikChange II 部位特異的突然変異誘発キットに従って構築されました。 プラスミドの維持には、大腸菌では 100 μg/mL アンピシリンを使用し、黄色ブドウ球菌では 10 μg/mL エリスロマイシンを使用しました。 プラスミドをDH5αから抽出し、続いてエレクトロコンピテント黄色ブドウ球菌RN4220に形質転換し、そこからプラスミドを再度抽出し、最後にエレクトロコンピテント黄色ブドウ球菌8325-4/ΔclpP細胞に形質転換した。 プラスミド選択にはエリスロマイシンを 10 μg/mL で使用し、タンパク質発現を誘導するために 1 ng/mL ATC を添加しました。

SaclpP-F1 プライマー: GTAACAGTTATTACAAGGAGG

SaclpP-R1 プライマー: AGGGGGCCCTTATTTTGTTTCAGG

SaclpPI91W-F プライマー: GATGTTCAAACATGGTGTATCGGTATGGC

SaclpPI91W-R プライマー: GCCATACCGATACACCATGTTTGAACATC

タンパク質の過剰発現は、ウェスタンブロットを使用して検出されました。 細菌の一晩培養物を、２２０ｒｐｍで通気しながらＴＳＢ中で１：１０００に希釈した。 OD600 が 0.6 に達したとき、1 mL の培養物を収集し、12,396 × g で 3 分間遠心分離しました。 沈殿物をＰＢＳで３回洗浄し、０．７５Ｕのリソスタフィン（Ｓｉｇｍａ）を含む１００μＬのＰＢＳに３７℃で３０分間再懸濁した。 次にサンプルを 12,396 × g、4 °C で 30 分間遠心分離し、上清を収集しました。 タンパク質濃度はBCAタンパク質アッセイキット(Beyotime)を用いて定量した。 サンプルを SDS ローディングバッファーで希釈し、100 °C で 10 分間加熱し、分析のために SDS-PAGE にロードしました。 タンパク質をニトロセルロース膜 (Millipore) に移し、5% スキムミルクを含む TBST で室温で 1 時間ブロックし、続いて SaClpP (1:5,000) および SaGAPDH (1:5,000) の一次抗体と 4 °C でインキュベートしました。 C一晩。 次いで、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：１０，０００）を添加した。 増強された化学発光 (ECL) をオートラジオグラフィーに使用し、画像は GE ImageQuantLAS4000 でキャプチャされました。

clpP、ΔclpP、および相補された clpP または I91W 変異体の遺伝的背景を持つ黄色ブドウ球菌 8325-4 株を、無傷細胞における SaFtsZ 分解についてアッセイしました。 一晩培養したものを 1:200 に希釈し、さまざまな濃度の各化合物 (0、5、10、および 20 μM、DMSO の最終濃度 1%) とともにインキュベートしました。 OD600 が 0.7 に達したら、300 μg/mL スペクチノマイシンを添加し、反応を 37 °C、220 rpm で 3 時間実施しました。 次に、各サンプルを 1 mL 採取し、PBS で 3 回洗浄しました。 細胞を再懸濁し、0.75 U リソスタフィンを用いて 37 °C で 30 分間溶解しました。 溶解した細胞抽出物の上清を分離し、BCA Protein Assay Kit を使用してタンパク質の濃度を測定し、続いてウェスタンブロット分析を行いました。 定量分析は、ImageJ ソフトウェアを使用して実行されました。 SaFtsZ分解の程度は、SaGAPDHに対するSaFtsZのバンド強度を測定することによって決定され、DMSOパネルは1.0とみなされた。

黄色ブドウ球菌 8325-4 の単一コロニーをピックアップし、TSA で一晩振盪しながら増殖させました。 培養物を 1:1000 で希釈し、OD600 = 0.6 まで増殖させました。 次に、培養物を PBS に再懸濁し、各化合物の 4 × MIC の (R)-ZG197、(S)-ZG197、ADEP 4 または ONC212 を含む MHA プレート上に 5 × 106 細胞を播きました。 24 時間後、MIC 決定と配列決定のために耐性コロニーをランダムに選択しました。 ＳａｃｌｐＰ遺伝子をＰＣＲによって増幅し、変異部位を決定するために配列決定した。

SaclpP の増幅に使用したプライマーの配列を以下に示します。

SaclpP-F2 プライマー: GTTATTACAAGGAGGAAAT

SaclpP-R2 プライマー: CAGACAGCTTAGTCTACTC

黄色ブドウ球菌株の一晩培養物を新鮮なTSB培地で1:200に希釈し、DMSOまたは20μMの(R)-および(S)-ZG197とともにインキュベートし、その後37℃、220rpmで3時間振盪した。 培養物をＰＢＳで３回洗浄し、ＯＤ６００が１．５になるまで再懸濁した。 次に、50μLの培養物を採取し、24ウェルプレート(Corning)中の300μLの2.5%グルタルアルデヒド(TED PELLA)を用いて13mmのカバーガラス上に4℃で一晩固定した。 翌日、各ウェル中のグルタルアルデヒドを除去し、ＰＢＳで３回洗浄した。 次に、サンプルをオスミウム酸で 30 分間注意深く染色し、その後 ddH2O で 3 回洗浄しました。 サンプルは、各段階で穏やかに振盪しながら、段階的な一連のエタノール (30、50、70、80、95、100%) で 10 分間脱水されました。 次に、サンプルを液体 CO2 (Leica EM) で臨界点乾燥し、サンプルの元の外観を維持しました。 乾燥したサンプルは、スパッタ コーティング (Leica EM) によって金膜でコーティングされました。 サンプルは、FEI Quanta 250 で加速電圧 15 kV で画像化されました。 画像はAdobe Photoshop CS5で記録され、コントラストと明るさが調整されました。

黄色ブドウ球菌 8325-4 またはレスキューした SaclpPI91W 株の一晩培養物を新鮮な TSB で 1:200 に希釈し、DMSO または (R)-ZG197、(S)-ZG197、および ONC212 を含む 10 μM 化合物とともにインキュベートしました。 2時間。 各培養物 1 ミリリットルを収集し、PBS で 3 回洗浄しました。 次に、サンプルをカクテル阻害剤（Sangon Biotech）を含む PBS に再懸濁し、50 μL のアリコートに分割し、サーマルサイクラー（BIO-RAD）を使用してさまざまな温度で 3 分間加熱しました。 次に、細菌を 0.75 U リソスタフィンで 37 °C で 30 分間溶解し、その後液体窒素で 3 回の凍結融解サイクルを行って細菌を完全に分解しました。 可溶性ライセートを 12,396 × g、4 °C で 20 分間の遠心分離によって収集し、上清をウェスタンブロットによって分析しました。 SaClpP (1:5,000) および SaGAPDH (1:5,000) の一次抗体を使用しました。 3 つの独立した実験が実行され、代表的な結果の 1 つが示されています。

HEK 293 T/17 細胞をトリプシンで消化し、収集しました。 細胞沈降物を、カクテル阻害剤（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含むＰＢＳに再懸濁し、液体窒素を用いた３回の凍結融解サイクルによって溶解した。 次に、溶解したサンプルを 12,396 × g で 30 分間遠心分離して破片を除去しました。 遠心分離後、上清を (R)-ZG197、(S)-ZG197、および ONC212 を含む 10 μM 化合物とともに 20 分間インキュベートし、その後 0.2 mL PCR チューブに移し、続いて指定の温度で 3 分間変性させました。 次に、可溶性上清を遠心分離によって収集し、ウェスタンブロットによって分析しました。 HsClpP (1:2,000) および β-actin (1:5,000) の一次抗体を使用しました。 3 つの独立した実験が実行され、代表的な結果の 1 つが示されています。

培養物を、OD600が0.4〜0.6に達するまで、220rpmで振盪しながら37℃のMHB培地で一晩増殖させ、その後、最終OD600が0.025となるようにMHB培地で希釈した。 様々な濃度の化合物を、３連で希釈細菌培養物（最終体積１００μＬ／ウェル、最終ＤＭＳＯ濃度１％）に添加した。 目に見える細菌の増殖を阻害する抗生物質の最低濃度は、37 °C で 18 時間インキュベートした後に記録されました。 MIC 値は 3 つの独立した実験によって決定されました。

USA300の一晩培養物を、最終OD600が0.025となるようにTSBで希釈し、37℃、220rpmで対数期中期（OD600が0.6）まで培養しました。 その後、細胞を TSB で 1 × 106 CFU/mL に希釈し、DMSO、バンコマイシン (20 μg/mL、10 × MIC)、(R)-ZG197 (5 μg/mL、10 × MIC)、(S) で処理しました。 -ZG197 (80 μg/mL、10 × MIC)、または ONC212 (5 μg/mL、10 × MIC)。 37℃、220rpm、200μLで6時間インキュベートした後、200μLの培地を採取し、PBSで3回洗浄した。 次に、各条件の希釈液を化合物の非存在下でプレーティングし、TSA プレート上で 37 °C で一晩増殖させました。 翌日、コロニーの数を計数することによってCFUを測定した。

MRSA 持続菌の根絶に対する (R)-および (S)-ZG197 の効果を試験するために 2 つのアッセイを実施しました。 まず、定常期で増殖する黄色ブドウ球菌細胞を適用しました61。 一晩培養した後、固定相 MRSA USA300 を BHI ブロスで調製し、(R)-ZG197 (10 μg/mL)、(S)-ZG197 (80 μg/mL)、シプロフロキサシン (8 μg/mL) の存在下でインキュベートしました。 、またはリファンピシン (0.4 μg/mL) を 37 °C、220 rpm で通気します。 示された各時点 (0、24、48、および 72 時間) で、100 μL の培養物を採取し、12,396 × g で 2 分間遠心分離しました。 次いで、混合物をＰＢＳで３回洗浄した。 10倍の段階希釈を実施し、各希釈液10μLを取り出してTSAプレート上にスポットした。 すべてのプレートを 37 °C に一晩置きました。 翌日、コロニーの数を計数することによってCFUを測定した。

2 番目の持続細胞アッセイは、二相殺傷分析を使用して実行されました 23。 一晩、定常期の USA300 培養物を TSB で 1:100 に希釈しました。 まず細菌をシプロフロキサシン (8 μg/mL、10 × MIC) とともに 220 rpm で通気しながら 37 °C で 6 時間インキュベートし、残りの細胞が生存残存細胞を形成しました。 次に、(R)-ZG197 (10 μg/mL)、(S)-ZG197 (80 μg/mL)、ADEP 4 (5 μg/mL)、シプロフロキサシン (8 μg/mL)、またはリファンピシン (0.4 μg/mL) を加え、指定の時点 (0、2、4、6、8、12、24、および 48 時間) で 100 μL のサンプルを採取し、12,396 × g で 2 分間遠心分離しました。 次に、サンプルを PBS に再懸濁しました。 翌日、コロニーの数を計数することによってCFUを測定した。

293T/17 および HK-2 細胞株に対する化合物の毒性は、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド (MTT) アッセイによって実施されました。 哺乳類細胞 (3000 細胞/ウェル) を 96 ウェル プレートに播種して一晩接着させ、一連の希釈した ICG-001、(S)-ZG197、(R)-ZG197、または ONC212 で 72 時間処理しました。 続いて、10μLの調製MTT溶液(PBS中5mg/mL)を各ウェルに添加し、次いで細胞を37℃でさらに4時間インキュベートした。 上清を除去した後、各ウェル中のホルマザン沈殿物をDMSOに溶解し、Tecan Spark 10mプレートリーダーにより波長490nmで吸光度を測定した。 DMSOを対照として使用し、その生存率を100%とみなしました。 IC50 値は、用量反応曲線を当てはめることによって計算されました。 すべての実験は 3 回繰り返して実行されました。

Wnt/β-カテニンシグナル伝達は、以前に記載されているように修正を加えた TOPFlash/FOPFlash レポーターアッセイを使用して検出されました 39。 TOPFlash (#21-170、Millipore) を Wnt 応答性レポーターとして使用し、FOPFlash (#21-169、Millipore) は変異型 Wnt 非応答性レポーターでした。 約 1.5 × 105 個の HEK 293 T/17 または HK-2 細胞を 24 ウェル プレートに播種しました。 付着後、メーカーの指示に従って、リポフェクタミン 2000 (Invitrogen, USA) を使用して、細胞を 500 ng の Firefly レポーター TOPFlash または FOPFlash でトランスフェクトしました。 一方、50 ng のウミシイタケレポーター pRL-TK (Promega) を内部対照として同時トランスフェクトし、トランスフェクション効率と回収効率の両方の差を補正しました。 トランスフェクションの6時間後、培養培地を、20 mM LiClおよび示された濃度の化合物の存在下でDMEM増殖培地に交換した。 24時間後、細胞を溶解し、製造業者の指示に従ってデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム(#E1910、Promega)によって検出した。 ホタルルシフェラーゼ活性 (TOPFlash または FOPFlash) をウミシイタケルシフェラーゼ活性 (pRL-TK) で正規化しました。 Wntシグナル伝達活性は、正規化されたTOPFlash/FOPFlash値として表されました。

ゼブラフィッシュ (生後 7 ～ 11 か月、性別に関係なく 300 ± 50 mg) を、実験に供する前に少なくとも 3 日間、定期的に餌を与えながら 10 L 水槽で維持しました。 安全性プロファイルは、未感染ゼブラフィッシュ (各グループ n = 11) に 25、50、または 100 mg/kg の化合物 (5% DMSO、20% PEG 300、5% ソルトール、および 70% PBS に溶解) を腹腔内注射することによって実施されました。 。 感染に対する適切なブドウ球菌量を決定するために、ゼブラフィッシュに連続 CFU の細菌を投与し、生存率を 5 日間モニタリングしました。 １つのグループのゼブラフィッシュに、ブランク対照として同量のＰＢＳ（８μＬ）を腹腔内注射した。

化合物の抗感染効果を調べるために、ゼブラフィッシュに黄色ブドウ球菌株 (USA300、Newman、Newman ΔclpP または MRSA XJ049) を指定の CFU で腹腔内注射しました。 感染後３０分後、ゼブラフィッシュを異なるグループにランダムに分け、続いて２５または５０ｍｇ／ｋｇの用量の化合物およびビヒクル対照を投与した。 ゼブラフィッシュの生存率を 5 日間記録しました。

感染モデルは、以前に報告された方法にいくつかの変更を加えたものに従って確立されました62。 マウス（６～８週齢、１８～２０ｇ）の背中を剃り、感染の前日に脱毛クリームで処理した。 黄色ブドウ球菌 USA300 の一晩培養物を 1:1000 に希釈し、OD600 0.6 まで増殖させました。 次に、培養物を PBS で 3 回洗浄し、5 × 107 CFU/mL の濃度で再懸濁しました。 感染前に、マウスを70 mg/kgのペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射により麻酔した。 50 μL の黄色ブドウ球菌 USA300 懸濁液 (2.5 × 106 CFU を含む) のアリコートを剃毛領域に皮下注射しました。 感染後 16 時間で、マウスをランダムに異なるグループに分けました (グループあたり n = 9)。 病変面積は、式 A =​​ π(L/2) × W/2 (A、面積、L、長さ、W、幅) を使用して測定および計算されました。 初期病変面積の差異は各群において有意ではない。 次に、50 μL の 7.5 mg/kg 化合物 (5% DMSO、20% PEG 300、5% ソルトール、および 70% PBS に溶解) およびビヒクル (陰性対照として) を感染皮膚の近くに皮下注射しました。 治療は 1 日 2 回、3 日間適用されました。 次いで、マウスを屠殺し、皮膚をその下にある筋膜および筋肉組織から分離した。 各グループの 9 つの皮膚サンプルのうち 1 つをランダムに使用し、4% パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋しました。 顕微鏡観察のために、薄い切片を切断し、H&E で染色しました。 各グループの残りの 8 つの感染皮膚サンプルを無菌的に切除して重量を測定し、その後 1 mL の PBS 中でホモジナイズしました。 段階希釈したホモジネートを TSA プレートにプレーティングし、37 °C で一晩インキュベートしました。 細菌数は組織 1 mg あたりの log10 CFU として表されました。

すべての統計分析は、GraphPad Prism 8 (GraphPad ソフトウェア) を使用して実行されました。 ログランク検定を実行して 2 つの生存曲線を比較しました。 両側の対応のないスチューデントの t 検定を実行して、グループ間の平均を比較しました。 データは平均値 ± SD として表示されます。 P値は図に示されています。 独立した実験/マウス/サンプルの数は図の凡例に記載されています。 レプリケーションの試みはすべて成功します。 すべてのブロットとゲルは 3 回実行され、単一の実験画像が示されています。 マウスの皮膚感染実験、SEM および H&E 染色を 1 回実施しました。 各サンプルから少なくとも 5 つの代表的な SEM 画像が記録されました。 H&E 染色の 3 つの代表的な画像が各サンプルで撮影され、1 つが表示されます。 SEM または H&E 染色で記録されたすべての画像は、同様の傾向を示しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で生成された原子座標および構造因子データは、ZG180/HsClpP の場合はアクセッション コード 7WH5、ZG180/SaClpP の場合は 7WID、(R)-ZG197 の場合は 7XBZ でタンパク質データ バンク (PDB、www.pdb.org) に寄託されています。 /SaClpP、および 7WGS は、それぞれ (S)-ZG197/SaClpP 構造を表します。 この研究で使用された他の X 線構造データは、アクセッション コード 6TTY、6TTZ、3STA、および 1TG6 で PDB データベースから入手できます。 アミノ酸配列は、HsClpP については NP_006003、MoClpP については CAA06443、DaClpP については NP_001018520、SaClpP については KFL07692、および EcClpP については CAD6014684 のアクセッション番号で国立バイオテクノロジー情報センター (NCBI) で見つけることができます。 この研究で生成されたすべての関連データは、補足情報およびソース データ ファイルで提供されます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。 データは、リクエストに応じて対応する著者から入手できます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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リファレンスをダウンロードする

我々は、黄色ブドウ球菌 NCTC 8325-4 および 8325-4/ΔclpP を寄贈してくださった Hanne Ingmer 博士 (デンマーク王立獣医農業大学) と、Ziahai Zhou 博士 (中国、上海有機化学研究所) に感謝します。 pPSUMO ベクターの賜物。 データ収集をサポートしていただいた上海シンクロトロン放射施設の BL19U1 および BL02U1 ビームラインのスタッフに感謝します。 施設のサポートをしていただいた復旦大学上海公衆衛生臨床センター実験動物モデル科のスタッフに感謝します。 この研究は、中国国家自然科学財団 (C.-GY への 22037007、81861138046 および 21725801、および TZ への 22107109) から資金提供を受けました。

Bingyan Wei、Tao Zhang、Pengyu Wang の著者も同様に貢献しました。

中国科学院大学杭州高等研究院薬理工学部、杭州、310024、中国

ウェイ・ビンヤン、ワン・ペンユー、パン・イーフイ、ラン・レフフ、ヤン・ツァイグアン

国家重点薬品研究研究所、ケミカルバイオロジーセンター、上海マテリアメディカ研究所、中国科学院、上海、201203、中国

ウェイ・ビンヤン、タオ・チャン、ワン・ペンユー、パン・イーフイ、リー・ジアフイ、ラン・レフフ、ヤン・ツァイグアン

中国科学院大学、北京、100049、中国

ウェイ・ビンヤン、ワン・ペンユー、パン・イーフイ、リー・ジアフイ、ラン・レフフ、ヤン・ツァイグアン

上海理工大学物理科学技術学部、上海、201210、中国

ウェイジョン・チェン & Quanjiang Ji

同済大学医学部臨床検査医学科、上海東病院、上海、200123、中国

ミン・チャン & ウェンジュアン・ウー

復旦大学生命科学部、上海、200433、中国

ガン・ジェンファ

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C.-GY がこのプロジェクトを発案し、研究を監督しました。 BW は、TZ、PW、YP、JL、WC、MZ の協力を得て研究を実施しました。 TZ は活性化因子を合成しました。 QJ、WW、LL、JG、C.-GY がエージェントとデータ分析に貢献しました。 BW、TZ、PW、C.-GY が原稿を書きました。 著者全員が結果について議論し、原稿についてコメントしました。

Cai-Guang Yang 氏への通信。

BW、TZ、PW、および C.-GY は、記載された研究に関連する係属中の特許出願 (CN202210377247.X、中国特許庁宛) の発明者として指名されています。 特許出願人は中国科学院上海マテリアメディカ研究所です。 申請ステータスは正式出願です。 ZG180、(R)-ZG197、(S)-ZG197の構造は特許出願中です。 残りの著者は競合する利益を宣言していません。

マウスの皮膚感染実験のプロトコールは、上海公衆衛生臨床センターの施設内動物管理使用委員会 (IACUC) によって検討され、承認されました。 実験は、関連する倫理ガイドラインおよび規制に従って実施されました。 実験動物使用許可証（SYXK-HU-2015-0027）は上海科学技術委員会によって認証されています。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Youfu Luo、Dacheng Wang、Maria Bewley およびその他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

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転載と許可

Wei、B.、Zhang、T.、Wang、P. 他。 黄色ブドウ球菌ClpPの種特異的活性化因子を使用した抗感染症療法。 Nat Commun 13、6909 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-34753-0

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受信日: 2022 年 4 月 12 日

受理日: 2022 年 11 月 7 日

公開日: 2022 年 11 月 14 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34753-0

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