生体分子をセミカプセル化して直接カプセル化

Scientific Reports volume 12、記事番号: 21391 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

区画化は、生物学的活性物質を環境から保護したり、診断、治療、その他の生物工学用途のための生体分子の独自の組み合わせを作成したりするなど、さまざまな目的に役立ちます。我々は、低分子量ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（PEG-DA 258）から作られた生体適合性と半透過性のマイクロカプセルに分子を直接カプセル化する方法を紹介します。マイクロカプセルは、非平面 PDMS マイクロ流体チップを使用して生成され、水中 PEG-DA 258 水中ダブルエマルジョンのワンステップ生成を可能にし、UV 光で重合してポリ PEG-DA 258 シェルになります。半透過性マイクロカプセルは、PEG-DA 258 に不活性溶媒を添加することによって得られます。ポリ PEG-DA 258 の良好な親水性により、タンパク質はカプセル殻に吸着せず、酵素を直接カプセル化することを実証します。活性を維持するためにカプセル内で乾燥させることもできます。最後に、カプセル透過性を利用して、区画化された DNA 鎖置換反応を使用した 2 層通信カスケードを実装します。この研究は、活性生体分子を半透過性マイクロカプセルに直接カプセル化することを示しており、私たちのプラットフォームが人工細胞の開発やカプセル化された診断薬や治療薬の生成を促進すると期待しています。

マイクロ流体工学、材料科学、合成生物学、生物工学の最近の進歩により、ミクロンサイズのコンパートメントの精密工学が可能になり、ますます複雑化する生体分子システムの操作が可能になりました1,2。液滴マイクロ流体技術は、Datta et al.3 によってレビューされているように、二重エマルションまたは重合性相を含む高次エマルションからテンプレート化された、正確に定義されたサイズと構造を備えたポリマーコンパートメントの製造を可能にします。中間相として使用されるポリマー前駆体の 1 つの欠点は、得られた重合コンパートメントが一般に溶質の透過に対して密閉されていることですが、Kim ら 4 は、不活性希釈剤を導入することによって半透性ポリマーシェルを製造できることを実証しました。ポリマー前駆体相のポロゲン。 UV 重合では、重合誘起相分離 (PIPS) と呼ばれるプロセスで、非反応性ポロゲンが重合ポリマーから排除されます。しかし、この研究で使用したポリマー、および水非混和性前駆体から得られるほとんどのポリマーの欠点は、重合したカプセルシェルの疎水性によりタンパク質の吸着が起こり、タンパク質や酵素の直接カプセル化が妨げられることです。

最近、分子量 258 g/mol PEG-DA 258 の PEG-ジアクリレートが、マイクロ流体キャピラリーデバイスでダブルエマルションを製造するための重合性中間相として使用できることが示されました 5。研究者らはまた、ポリPEG-DA 258が、高分子量の水溶性PEG-DA誘導体から作られたヒドロゲルと同様の親水性を有することを示した。このような有利な特性により、ポリマーシェルへの顕著な吸着なしにフィブリノーゲンを直接カプセル化することができました。しかし、製造されたカプセルも気密性があり、小分子染料（エリオグラウシン二ナトリウム塩：793 g/mol、オイルレッド O：408 g/mol）でさえもカプセルからの拡散を妨げ、その使用と応用範囲が大幅に制限されてしまいます。そんなカプセル。

生物学的に活性な高分子を生体適合性の半透性カプセルに直接カプセル化するために、低分子量 PEG-DA 258 の有利な特性と PIPS による細孔形成を組み合わせました。この研究では、水中水型PEG-DA 258の二重エマルジョンを生成するための表面処理を必要としない、流れ集束、同軸、非平面形状のPDMSマイクロ流体デバイスを使用しました。半透性カプセルを得るために、PIPSを使用してカプセルシェルに小さな孔を形成しました。さまざまなサイズの蛍光カーゴをカプセル化するか、空のカプセルをフルオロフォア含有溶液に入れることによって、我々は、カプセルが半透過性であり、32.7 kDa 以上のタンパク質と酵素を直接カプセル化しながら、より小さな分子の輸送を可能にするカットオフサイズを備えていることを示しました。生体分子は分解されることなくカプセル内に保持され、カプセル内に均一に分布していました。カプセル化された酵素はトレハロース中での風乾に耐え、再水和後も酵素活性を維持しました。半透性カプセルは環境と通信することができ、2 つの異なるマイクロカプセル集団の液体コア内で DNA 鎖置換反応を固定化することにより、2 層のシグナル伝達カスケードを実現することができました6。まとめると、この研究は、診断、治療、または合成生物学の用途で使用するさまざまな生体分子のカプセル化に使用できる、生体適合性ポリマーシェルを備えた半透性マイクロカプセルの開発と特性評価について説明します。

PEG 誘導体は一般に生体適合性、生体不活性、生分解性があると考えられているため 7、マイクロカプセル製造用の前駆体として、PEG-DA MW 700、PEG-DA MW 575、PEG-DA MW 258 などの低分子量のさまざまな PEG-DA をテストしました。 UV照射による光重合後。 MW 575 以上の PEG-DA の場合、水混和性により二重エマルションを容易に形成できません。レオナヴィセンら。最近、内相にPEG-DA MW 575と高分子量PEG-DA MW 8000を組み合わせることで二相系が得られ、PEG-DAをカプセル材料として使用してコアシェルカプセルを形成できることを示しました8。しかし、Nam et al.5 によっても報告されているように、水と混和しないため、PEG-DA MW 258 を潜在的なポリマー前駆体として使用する代替アプローチを検討しました。 PEG-DA MW 258 のこの特性により、PEG-DA MW 258 をダブルエマルジョンの中間相として使用することができ、PDMS デバイスでの液滴生成と互換性がありました (図 1A)。ダブルエマルションを形成するために、10% PVA を添加した水性連続相を使用しました。 PEG-DA 258 中間相には光開始剤 (HMPP) と界面活性剤 (Span80) が追加されており、場合によっては穏やかな有機溶媒も追加されます。水性連続相の流量 2500 \(\upmu \)L/h、PEG-DA MW 258 中間相の流量 200 \(\upmu \)L/h のジェッティング方式で単分散二重エマルジョンを生成しました。水性内相の場合は 250 \(\upmu \)L/h (図 1B)。興味深いことに、疎水性中間相による収集チャネルの湿潤を防ぐPDMSデバイスの非平面形状により、デバイスの表面処理を必要とせずに二重エマルションを生成できました。

3D 形状の PDMS デバイスでの半透性マイクロカプセルの製造。 (A) 3D ジオメトリを使用した PDMS デバイスの概略図。 W/O/W ダブルエマルションは、内部の水性コアをカプセル化する PEG-DA 258 中間相で生成されます。 (B) PDMS デバイスの動作の顕微鏡写真。 (C) 収集されたダブルエマルジョンの UV 重合後に得られたマイクロカプセルの明視野画像。 (D) 重合マイクロカプセルの代表的なバッチのサイズ分布。 (E) UV 照射時の PIPS の概略図。 15% 酢酸ブチル (ポロゲン) を PEG-DA 258 と混合して、半透過性マイクロカプセルを形成しました。 (F) 収集されたダブルエマルションでは、高分子量 500 kDa FITC-デキストランと低分子量 40 kDa RITC-デキストランの両方が内部水相に保持されます。 (G) UV 重合と PIPS の後、カプセルシェルに細孔が形成され、カプセルは半透過性になります。

ダブルエマルジョンを UV 透過性のキュベットに 15 分間収集し、その後、UV 照射によりカプセルをバッチで重合させました。重合後、平均直径 62 \(\upmu \)m の単分散カプセルが得られました (図 1C、D)。同様の PDMS デバイスを使用した以前の結果によれば、変動係数は 5% 近くでした9。顕微鏡画像の検査から、カプセルの殻の厚さは 5 ～ 10 \(\upmu \)m であると推定されました。我々の結果は、水と混和しないPEG-DA MW 258が適切な中間相であるというNam et al.5の観察を裏付けるだけでなく、表面処理を必要としないPDMSデバイスでの二重エマルション生成との適合性を実証しました。その結果、多孔質の薄いシェルを備えた単分散ポリ PEG-DA 258 マイクロカプセルが生成されました (図 1E ～ G)。

PEG-DA 258 マイクロカプセルは半透過性で、ポロゲンを変更することで細孔サイズを調整できます。 (A) 15% 酢酸ブチルまたは (C) 15% 1-デカノールをポロゲンとして使用して生成された PEG-DA 258 マイクロカプセルの概略図。 15% 酢酸ブチルマイクロカプセルは、32.7 kDa EGFP を排除しながら、10 kDa RITC デキストランを選択的に透過させました。ポロゲンとして 15% 1-デカノールを使用して生成されたマイクロカプセルの細孔サイズが大きいため、両方の蛍光分子の拡散が可能になりました。 (B) 15% 酢酸ブチルまたは (D) 15% 1-デカノールポロゲンを使用して生成したマイクロカプセルを、10 kDa RITC-デキストランおよび 32.7 kDa EGFP を含む溶液に浸漬しました。 Cy3 および FITC チャネルの蛍光シグナルの変化は、5 分、1 時間、および 24 時間後に観察されました。 15% 1-デカノールを使用して生成されたマイクロカプセルは両方の蛍光分子に対して透過性でしたが、ポロゲンとして 15% 酢酸ブチルを使用して生成されたマイクロカプセルの選択的透過性が明確に観察されました。

半透性カプセルを製造するために、PIPS4,10 でポロゲンとして機能する穏やかな不活性溶媒である酢酸ブチルを中間相に添加しました。 Kim ら 4 は酢酸ブチルを使用して、エトキシル化トリメチロールプロパントリアクリレート (ETPTA) とグリシジルメタクリレート (GMA) の架橋ネットワークで構成される薄いシェルに直径 30 nm 未満のナノ細孔を形成しました。半透性カプセルの透過性を評価するために、500 kDa FITC-デキストランと 40 kDa TMR-デキストランを内水相に添加したところ、重合カプセルのほぼ 90% がカプセルの後に 500 kDa FITC-デキストランを保持していることが観察されました。水性緩衝液中での連続遠心分離により徹底的に洗浄し、続いて4 \(^{\circ }\)℃の緩衝液中で24時間インキュベートした(図1G)。一方、低分子量の 40 kDa TMR デキストランを保持しているカプセルは約 40% のみでした。これらの結果は、高分子量の蛍光体のみが保持されているカプセルによって証明されるように、一部のカプセルは半透過性であることを示しました。この実験からカットオフサイズを正確に決定することはできませんでしたが、カットオフサイズは 500 kDa をはるかに下回り、より小さな蛍光団のサイズである 40 kDa に近い可能性があると推定されました。

半透性をよりよく特徴付けるために、空のカプセルを準備し、より小さい分子量の蛍光分子の溶液中に入れました (図 2)。 10 kDa RITC デキストランと 32.7 kDa EGFP の両方を含む溶液に、15% 酢酸ブチルポロゲンを使用して生成した空のカプセルを配置しました (図 2A、B)。我々は、ほとんどのカプセルが、低分子量の 10 kDa RITC デキストランに対応する赤色蛍光チャネルのシグナルの比較的急速な増加を示したことを観察しました。 1 時間のインキュベーション後、ほとんどのカプセルは赤色の蛍光シグナルを示し、24 時間のインキュベーション後はすべてのカプセルが赤色の蛍光シグナルを示しました。同時に、これらのカプセルの大部分は、32.7 kDa EGFP に対応する緑色蛍光チャネルのシグナル増加を示さなかった。 2 つの蛍光チャネルからのシグナルを重ね合わせると、カプセルの大部分が半透過性であり、少なくとも 24 時間 EGFP を排除しながら、10 kDa RITC デキストランがカプセルの内部に拡散することが明らかにわかりました。しかしながら、カプセルの透過性にはある程度のばらつきが観察され、いくつかのカプセルはインキュベーションの数分後にすでにEGFPに対して透過性があるように見えましたが、いくつかのカプセルは1時間後でも依然として10 kDa RITC-デキストランを排除していました。

ポロゲンとして 1-デカノールを使用して、異なるサイズのカットオフを持つ半透性カプセルを得ました。 1-デカノールの使用は、形成ポリマーとの 1-デカノールの異なる相互作用パラメータにより、ETPTA/GMA ポリマーシェルに大きな細孔を作成することが Kim ら 4 によって報告されています。ここで、PEG-DA 258 に 15% の 1-デカノールポロゲンを加えて製造したカプセルも、酢酸ブチルポロゲンで製造したカプセルよりも高い透過性をもたらしたことを示します (図 2C、D)。わずか数分のインキュベーション後、カプセル内部で 32.7 kDa EGFP に対応する緑色蛍光シグナルの増加が観察され、24 時間後にはすべてのカプセルが蛍光を発しました。さらに、すべてのカプセルは 10 kDa RITC デキストランに対して完全に透過性でした。カプセルの透過性を変更するために、10% 酢酸ブチルを含むより少ない割合のポロゲンの使用も検討しました。かなりの割合のカプセルが、1時間のインキュベーション後に10 kDa RITC-デキストランに対応する蛍光シグナルを持たないことが観察され、透過性カットオフが低いことを示唆しています（補足図S1）。また、15％オクタノール（補足図S2）などのさまざまな溶媒をポロゲンとして使用しました。これにより、15％酢酸ブチルまたは15％デカノールポロゲンを使用して観察されたものの中間の透過性のカプセルが得られました。 15% 2-エチル-1-ヘキサノール (補足図 S3) を使用して、15% 酢酸ブチルに匹敵する透過性を持つカプセルを製造しました。これらの結果は、ポロゲン含有量と組成を変えることでカプセルの透過性を変更できること、およびさまざまな溶媒が半透過性カプセルのマイクロ流体製造に適合することを示しています。

半透性PEG-DA 258カプセル内にタンパク質を直接カプセル化。直接カプセル化するために、EGFP を水性内相に添加しました。 (A – C) FITC チャネルの蛍光シグナルを示すダブルエマルジョンの顕微鏡画像。 (D – F) 重合後も、蛍光シグナルはほとんどのカプセルの内部にまだ存在していました。細孔サイズの変動または 32.7 kDa EGFP に近いサイズカットオフにより、一部のタンパク質漏出が発生しました。 (G) パネル E に示されているカプセルの蛍光強度プロファイル。蛍光プロファイルは、シェル材料へのタンパク質の吸着がなく、カプセルの内部に EGFP が均一に分布していることを示唆しています。 (H–J) 直接カプセル化後の FITC-ストレプトアビジンを含む重合カプセルの顕微鏡画像。蛍光シグナルがすべてのカプセルに存在し、FITC-ストレプトアビジンの漏出には細孔サイズが小さすぎることを示唆しています。 (K) パネル I の 2 つのカプセルにわたる蛍光プロファイル。このプロファイルは、シェル材料へのタンパク質の吸着がなく、カプセル内部に FITC-ストレプトアビジンが均一に分布していることを示唆しています。

次に、ポリマーシェルへの吸着や機能の損失なしに、タンパク質を半透性ポリ (PEG-DA 258) マイクロカプセルに直接カプセル化できることを示します。我々は、カプセルの内部にタンパク質と酵素を保持しながら、より小さな生体分子をカプセルシェルを横切って輸送できるようにするために、ポロゲンとして 15% 酢酸ブチルを選択しました。最終濃度 2 \(\upmu \)g/mL になるように 32.7 kDa EGFP を内水相に添加することで、マイクロカプセル内に 32.7 kDa EGFP をカプセル化しました。 EGFP 蛍光シグナルは、沈殿の兆候なしでダブルエマルション内で観察され (図 3A-C)、一旦重合すると、カプセルはカプセル材料へのタンパク質吸着の兆候なしで均一な蛍光プロファイルを示しました (図 3D-) G)。また、60 kDa FITC 標識ストレプトアビジンを水性内相に最終濃度 50 \(\upmu \)g/mL でカプセル化しました。重合カプセル内の蛍光シグナルプロファイルは、カプセルシェルへのタンパク質吸着の兆候を示しませんでした (図 3H–K)。 PBS 中で 24 時間インキュベートした後、EGFP 含有カプセルの一部が蛍光シグナルを含まないことがわかりました (図 3D–F)。この観察は、これらの蛍光生体分子のサイズに近い透過性カットオフを示唆しています。また、バッチ UV 重合プロセスにより、カプセルの細孔サイズにある程度のばらつきが生じることが予想されます。このプロセスでは、キュベット内のカプセルの位置に応じて UV 強度がわずかに異なる可能性があります。また、一部のカプセルは破損または損傷しており、貨物の放出につながる可能性があります。より大きな分子量の 60 kDa FITC-ストレプトアビジンでは、ほとんどの重合カプセルが水性洗浄後に蛍光シグナルを含むことがわかり、カットオフサイズが FITC-ストレプトアビジンのサイズ未満であることがわかりました。

我々は、UV 重合後に得られたポリ PEG-DA 258 シェルが直接タンパク質のカプセル化に適合することを実証しました。使用された材料はカプセルシェルへのタンパク質の吸着を引き起こさず、重合誘発相分離プロセスにより、分子量 32.7 kDa 以上のタンパク質を保持するのに十分な小さな細孔が形成されました。

機能性酵素を半透過性PEG-DA 258マイクロカプセルに直接カプセル化します。ルシフェラーゼ-GFP融合タンパク質を半透性カプセルに直接封入しました。蛍光融合タンパク質により、二重エマルジョン内の酵素 (A) と重合カプセル内の酵素 (B) を視覚化できます。 (C) カプセル化されたエコノルシフェラーゼは、生物発光アッセイで強いシグナルを示します。 \(\beta \)-ガラクトシダーゼの直接カプセル化。 (D,E) 酵素を含むカプセルをトレハロースに分散し、37 \(^{\circ }\)C で風乾しました。 (F) CPRG を含む溶液で再水和した後、基質はクロロフェノールレッドに加水分解されました。 (G) 溶液は、\(\times \) 4 倍率の倒立顕微鏡に取り付けられたカラーカメラで画像化されました。カプセルの内部は紫色を示し、\(\beta \)-ガラクトシダーゼ酵素活性を示しました。

蛍光タンパク質のカプセル化に成功した後、酵素をカプセル化し、生成したカプセルを用いて酵素アッセイを実施しました。我々は、組換え GFP ルシフェラーゼ融合タンパク質 (econoLuciferase、Biosynth) を使用しました。これにより、蛍光シグナルを測定することでカプセル化を確認できました。融合タンパク質の分子量が 90 kDa を超えるため、マイクロカプセルの内部に酵素が保持されます。実際、二重エマルジョンと重合カプセルの両方に、エコノルシフェラーゼ蛍光融合タンパク質からの蛍光シグナルが含まれていることがわかりました。どちらの場合も、10% PVA 内溶液の一部の沈殿に起因すると考えられる蛍光シグナルの斑点状の分布が観察されました (図 4A、B)。エコノルシフェラーゼを含むカプセルを D-ルシフェリンを含む溶液中に置き、空のカプセルで観察されるシグナルよりも 2 桁高い生物発光シグナルを測定しました (図 4C)。これらの結果は、活性酵素をポリPEG-DA 258マイクロカプセルに封入することができ、半透性の殻により基質D-ルシフェリンがマイクロカプセルのコアに拡散して生物発光シグナルを生成できることを実証した。

2 番目の例では、酵素の機能を維持しながらカプセルを乾燥および再水和できることを示しました。分子量 465 kDa の四量体酵素である \(\beta \)-ガラクトシダーゼをカプセル化しました。酵素を含むカプセルを乾燥させ、再水和しても活性を維持できることを示すために、\(\beta \)-ガラクトシダーゼを含むカプセルを 0.5 M トレハロース溶液に分散し、小滴を 37 度のインキュベーター内で一晩乾燥させました。結果としてトレハロースペレットが得られます (図 4D、E)。乾燥ペレットをクロロフェノールレッド-\(\β\)-d-ガラクトピラノシド（CPRG）溶液で再水和した後、黄色のCPRGがクロロフェノールレッドに酵素的に変換される際の色の変化を観察しました。色の変化がカプセルの位置で起こっていることを観察し、4倍の対物レンズで視覚化すると、いくつかのカプセルの内部が強い紫赤色に変わることが示されました（図4F、G）。画像はクロロフェノールレッド濃度の定量化としては使用されませんでしたが、CPRG からクロロフェノールレッドへの変換が \(\beta \)-ガラクトシダーゼを含むカプセル内で起こっていることを明確に示しました。これらの結果は、活性酵素を半透性マイクロカプセルに直接カプセル化できる可能性を実証し、さらにカプセルをトレハロースの凍結保護溶液中で風乾でき、再水和後も活性を保持できることを示した。

半透過性マイクロカプセルへのDNA鎖置換反応ネットワークの固定化と2層シグナル伝達カスケードの実現。 (A) Joesaar らによって開発された 2 層シグナル伝達カスケードの概略図 6 (B) ポリ PEG-DA 258 カプセルにおける 2 層シグナル伝達カスケードの実装。 2 つのカプセル集団を混合し、50 nM インプット鎖の添加直後に細胞計数スライド上で画像化しました (A)。 Cy5 および Cy3 蛍光シグナルの増加は、それぞれ第 1 および第 2 集団の活性化に対応して観察されました。 (C) 検出された粒子の強度の中央値。活性化された最初の莢膜集団に対応して、Cy5 シグナルの増加が観察されました。シグナル鎖 (\(Q_1\)) が第 2 莢膜集団に放出および拡散した後、その後の活性化に対応して Cy3 シグナルの増加が観察されました。大きな記号は、特定の蛍光チャネルで検出されたすべての粒子の中央値に対応します。

私たちは、より複雑な生体分子システムをカプセル化する可能性を調査しました。これは、診断、治療、またはセラノスティック用途における刺激の感知と応答に使用できる可能性があるためです。最近、DNA 鎖置換 (DSD) 反応が、原細胞コミュニケーションおよび分散生体分子計算 6 のモデルとして、プロテイノソームマイクロコンパートメント 11 内で実行できることが実証されました。ここでは、Joesaar et al.6 の設計に従い、ストレプトアビジンを含むポリ (PEG-DA 258) カプセルにビオチン化 DNA 鎖を固定化しました。

我々は、ssDNA 入力鎖 (A) によるトーホールド変位後に活性化するトランスデューサー DSD ゲートでカプセルの最初の集団を機能化することにより、2 層シグナル伝達カスケードを実装しました。これにより、シグナル鎖 (Q1) が解放され、Q1 の消光が解除されます。 Cy5 蛍光色素。 (Q1) シグナル鎖は、トランスデューサー増幅器 DSD ゲートで機能化されたカプセルの第 2 集団を活性化し、第 2 シグナル鎖 (Q2) を放出し、今度は Cy3 蛍光色素の消光を解除します。また、増幅器として機能する燃料ストランドも追加しました (図 5A)。 2 つのカプセル集団を混合し、入力鎖 (A) を追加すると 2 層シグナル伝達カスケードが活性化されました。この実験では、2 つのカプセル集団を混合し、50 nM のインプット鎖 (A) を追加し、自由に移動するカプセルを細胞計数チャンバーにロードしました。まず、最初の DSD トランスデューサーゲートがアクティブになっているカプセルの最初の集団に対応する Cy5 信号の増加を測定しました。数分のタイムラグの後、トランスデューサーアンプ DSD ゲートを含むカプセルの 2 番目の集団に対応する Cy3 シグナルのその後の増加が見られました (図 5B、C)。最初の集団の約 10 カプセルで Cy5 の増加が観察され、第 2 集団の約 15 カプセルで Cy3 の増加が観察されました。 2 層カスケードの活性化は、入力鎖 (A) の濃度を変更することで変更できます。その濃度を100 nMに増加させると、最初の集団の活性化が大幅に加速され、最初のシグナル増加を捕捉することが困難になりました（補足図S4）。一方、(A) の濃度を 10 nM に下げると、活性化レベルが大幅に低下しました (補足図 S4)。すべての場合において、最初の集団の活性化と 2 番目の集団の活性化の間に 5 ～ 10 分の遅れが観察されました。これは、最近開発された区画化 DSD 反応の簡潔な実装ですが、これらの結果は、DSD 反応が当社の半透性マイクロカプセルに効率的にカプセル化され、通信する生体分子システムの構築に使用できることを実証しました。

この研究では、生体適合性と半透性のポリ PEG-DA 258 マイクロカプセルの製造と、機能を保持しながらタンパク質や DNA ネットワークをカプセル化するためのそれらの使用について紹介します。まず、本発明者らは、PEG-DA 258が、水中PEG-DA 258の水中ダブルエマルションから鋳型されたマイクロカプセルの製造のための重合性中間相として使用できることを示す。このようなダブルエマルジョンの生成にはガラス毛細管デバイスの使用は必要ありません 5 が、表面処理を必要としない 3D 形状の PDMS デバイスで生成できます 12。ポリ-PEG-DA 258マイクロカプセルの製造のための未処理PDMSデバイスの製造および使用における比較的単純な方法と再現性により、この方法は基本的なソフトリソグラフィー製造にアクセスできる多くの研究室で利用できるようになるはずです。

PEG-DA 258 中間相に不活性希釈剤を添加することにより、PIPS によって半透性マイクロカプセルが形成できることを示します。この技術は以前、ETPTA/GMA4 または EDGMA/GMA10 のブレンドなど、他のアクリレートベースのポリマーから作られた半透過性マイクロカプセルの形成に使用されていました。このようなポリマーから作られたカプセルの半透性は実証されているが、Niederholtmeyer et al.13 による ETPTA/GMA マイクロカプセルへのプラスミド DNA のカプセル化を除けば、生物学的成分の直接カプセル化は達成されていない。これらのカプセルに含まれるプラスミド DNA が、無細胞転写翻訳系に浸漬した後もタンパク質発現テンプレートとして機能する可能性があることに注目するのは興味深いことです。しかし、ETPTA/GMAカプセルは、カプセルシェルへのタンパク質の吸着を防ぐために、最初にアミノ-PEG12-アルコールと反応させる必要があり、このことはまた、そのようなポリマーの使用によってタンパク質または酵素の直接カプセル化が妨げられたであろうことを示している。

ここで、我々は、ポリPEG-DA 258マイクロカプセルが蛍光タンパク質や酵素などの生体分子の吸着を引き起こさず、半透過性マイクロカプセルの内部にそれらを直接カプセル化できるというNamらの以前の観察を確認する5。さらに、酢酸ブチルをポロゲンとして使用した場合にPIPSによって得られる小さな細孔は、32.7 kDaの小さなEGFPの流体力学的半径に近いか、それよりも小さいと推定されました。これにより、サイズがこのカットオフより小さくない限り、さまざまなタンパク質、RNA、DNA、またはその他の目的の（生体）分子のカプセル化が可能になります。我々は、活性酵素のカプセル化が可能であり、カプセルの半透性が酵素を放出せずに安定したカプセル化という課題を克服し、同時にカプセルの内外への反応物や生成物の拡散を可能にすることを示します。あるいは、ストレプトアビジンのカプセル化がより小さな分子の固定化パートナーとして機能できることを提案します。また、機能化された磁気ビーズまたは適切なサイズの粒子のカプセル化も、同じ目的に使用できます。将来の開発では、これはアフィニティータグを備えたペプチドや小さなタンパク質、さらには外部刺激を感知すると活性化または放出される小さな分子を固定化するのに役立つ可能性があります14。今回我々は、カプセル化されたストレプトアビジン上にビオチンハンドルで修飾された短い DNA 鎖を固定化することでこの概念を適用しました。これは、DNA 鎖置換 (DSD) 反応からの 2 層シグナル伝達カスケードの実現に役立ちました。 Joesaar ら 6 によって提案されたマイクロコンパートメントでの DSD 反応の実装は、もともとプロテインソームで実行されましたが、我々は、我々の半透過性マイクロカプセルがそのような複雑な合成生物学への応用も実装できることを示します。

この研究は、半透過性生体適合性ポリPEG-DA 258カプセルへの活性生体分子の直接カプセル化の最初の実証であるが、いくつかの制限がある。選択したカプセル化方法とパラメーターは選択した用途に適していましたが、無傷のマイクロカプセルの収量を増やし、特定の半透性カットオフを得るために改善が可能であることを認識しています。カプセルの透過性に影響を与える水性洗浄およびその他の下流プロセスにおけるポロゲンの効果的な除去をさらに改善して、より均質なカプセルを製造することができます。重合プロセスを開始する UV 照射の制御は PIPS にとって重要であり、望ましい透過性を生成するため、将来の開発ではインライン重合 15 を使用してカプセルを製造し、各ダブルエマルション液滴の均一な照射を確保する可能性があります。最後に、他の特定の用途に合わせた特性を備えたカプセルを製造するには、異なる相間の密度の一致、シェルの厚さの変更、およびさまざまなポロゲン、界面活性剤、および光開始剤の組成の探索が必要になります。

結論として、我々は、ダブルエマルジョンから鋳型されたポリ-PEG-DA 258 マイクロカプセルへのさまざまな生体分子のワンステップカプセル化を実証しました。生物学的活性を持つ蛍光分子、タンパク質、酵素、および DNA 鎖を、生体適合性の半透性カプセルのコアに充填することができます。これにより、診断、治療、合成生物学に応用できる、複雑で堅牢な多成分生体分子人工細胞の構築への扉が開かれます。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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著者らは、シリンジポンプのセットアップと初期プラットフォーム開発における貢献に対して Rohan Thakur に感謝します。彼らは、マイクロ流体デバイスのフォトマスクを提供し、予備実験を支援してくれた Esther Amstad 教授、Jui-Chia Chang、Gianluca Etienne 博士、および EPFL の SMaL 研究室に感謝します。 GMは、スイス国立科学財団のMD-PhDプログラム（SNF、323530\(\_\)171144）およびSNF NRP（国立研究プログラム）78 Covid-19 Grant 198412（SJMへ）によって支援されました。この研究は、EPFL MD-PhD 論文 No. 838516 の一部として出版されました。

ローザンヌ連邦工科大学生物工学研究所工学部、ローザンヌ、スイス

グレゴリー・ミチェリン & セバスティアン・J・メルクル

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GM と SJM が研究を計画しました。 GM は調査を実施しました。 GM と SJM は結果とデータを分析しました。 GMとSJMが原稿を書きました。

Sebastian J. Maerkl への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

michielin, G.、Maerkl, SJ ダブルエマルジョンで生成された半透性マイクロカプセルへの生体分子の直接カプセル化。 Sci Rep 12、21391 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-25895-8

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受信日: 2022 年 9 月 21 日

受理日: 2022 年 12 月 6 日

公開日: 2022 年 12 月 10 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25895-8

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