グルタミン酸の分子研究と生体内研究 | ShijiasunAgilePeak Ventures Co.,Ltd

Nature Communications volume 13、記事番号: 4446 (2022) この記事を引用

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224 オルトメトリック

メトリクスの詳細

グルテンの消化により有毒ペプチドが生成され、その中には免疫原性の高い小麦α-グリアジン由来のプロリンに富んだ33量体が含まれており、これがセリアック病の引き金となります。ピッチャー植物由来のネプロシンは、報告されているプロリルエンドペプチダーゼです。今回、我々は組換えネプロシンとその変異体を作製し、全長ネプロシンがチモーゲンであり、リジンプラグを特徴とするpHスイッチ機構を介して全βプロドメインが放出され、胃内pHで自己活性化されることを発見した。。触媒ドメインは、前例のない一対の触媒グルタミン酸を含む、拡張された活性部位の裂け目を備えた、典型的な 7+8 本鎖 β サンドイッチです。ネプロシンは、胃条件下で in vitro でグリアジンと 33 量体の両方を効率的に分解し、pH > 5 で可逆的に不活化されます。さらに、グリアジンとネプロシンチモーゲンを 500:1 の比率で同時投与すると、体内の 33 量体の存在量が減少します。マウスの小腸を最大90％減少させます。したがって、ネプロシンは、治療用グルテナーゼの要件を満たす真核生物グルタミン酸エンドペプチダーゼのファミリーを発見しました。

セリアック病（CoD）は、プロリンとグルタミンが豊富な穀物プロラミン貯蔵タンパク質のグループである食事性グルテンに対する遺伝的および環境的感作を持つ個人に影響を及ぼす慢性自己免疫性腸症です1,2。 CoDを引き起こすプロラミンには、小麦のグリアジンとグルテニン、大麦のホルデイン、ライ麦のセカリンなどがあります。腸の損傷は、1 日あたりわずか約 10 mg の食事性グルテンによって引き起こされる可能性があります 3。これは、典型的な西洋の食事で見られる量の 0.1% 未満です 2。 CoD はあらゆる年齢層にわたって世界的な健康上の負担となっており、世界の血清学的有病率は 1.4%4 であり、毎年 7.5% ずつ増加しています5。この病気は、免疫原的に最も関連性のある小麦α-グリアジンの 33 残基フラグメント (33 量体) を含む、部分的に分解されたグルテンペプチドによって引き起こされます 2,6。これらのペプチドは、プロリン含量が高い (33 量体中 13) ため、胃、膵臓、腸の刷子縁膜ペプチダーゼによるさらなる切断に抵抗します。セリアック病では、それらは小腸の粘膜上皮を通過し、そこでグルタミン残基が組織トランスグルタミナーゼによって脱アミド化されます。これにより、CoD2 の発症に必要なヒト白血球抗原 (HLA) 受容体の DQ2.5/DQ2.2 および DQ8 対立遺伝子に対するペプチドの親和性が高まります。受容体の結合は、T 細胞によって媒介される重度の炎症促進性自己免疫反応を引き起こし、上皮内リンパ球増加症、陰窩過形成、小腸絨毛の萎縮、粘膜炎症などの腸への影響を引き起こします2。これらは慢性的な栄養素の吸収不良、下痢、嘔吐、膨満感、腹痛、腸リンパ腫を引き起こします。腸管外の症状としては、思春期の遅れ、骨粗鬆症、軸索神経障害、小脳性運動失調7などがあり、セリアック病の平均余命を縮めます。 CoD には治療法がないため、患者は腸絨毛の正常な構造を回復する厳格なグルテンフリーの食事を生涯にわたって遵守する必要があります2。しかし、グルテンフリーの食事ではバランスの取れた栄養が得られず7、多くのセリアック病患者はそのような食事制限を守っていても腸症状に悩まされます8,9。さらに、グルテンはほとんどの加工食品や医薬品に含まれており、西洋社会では食事の遵守が困難になっています2。これにより、効果的な CoD 治療に対する需要が生まれました。

有望なアプローチの 1 つは、毒性ペプチドを切断し、乳糖不耐症に対するラクターゼ錠剤を彷彿とさせる、経口酵素療法用の真のグルテナーゼとして機能するエンドペプチダーゼの開発です 10、11、12。このようなアプローチは、世界的に有病率が最大 13% である非セリアック病グルテン過敏症や、有病率が 0.5% 未満の過敏性腸症候群に苦しむ患者にも有益となるでしょう 8,14,15。候補グルテナーゼは、臨床応用のために特定の基準を満たさなければなりません。まず、胃食塊が十二指腸に通過して自己免疫反応を開始する前に、消化中に胃内で機能する必要があり、したがって酸性胃環境（pH ～ 2.5）でも安定して活性を維持し、胃ペプシンに抵抗する必要があります。第二に、大量の食事性タンパク質の処理が必要な胃条件下でペプシンと組み合わせると、妥当な用量でグリアジンと 33 量体が効率的に消化されるはずです。第三に、腸の構造を傷つけたり、栄養素の吸収を阻害したりしてはならず、したがって、理想的には十二指腸のわずかに酸性の食後のpHでは不活性である必要があります16。

いくつかのグルタミニルおよびプロリルエンドペプチダーゼ (PEP) の治療可能性は、さまざまな触媒クラスと、細菌、真菌、昆虫、発芽穀物を含む多様な供給源を代表して評価されています 7、10、11、12。これらには、Aspergillus niger 由来のセリン PEP が含まれます 10,17。 STAN1、A. ニガーアスパラギン酸アスペルギロペプシンとアスペルギルスオリゼセリンジペプチジルペプチダーゼ IV18 の組み合わせ。ラチグルテナーゼ、オオムギ由来のグルタミン特異的システインペプチダーゼと、Sphingomonas capsulata 由来の修飾セリンプロリル特異的オリゴペプチダーゼの組み合わせです19。天然の経口定着体である Rothia aeria および Rothia mucilaginosa に由来するサブチリシン型セリンエンドペプチダーゼ 11。合成酵素 KumaMax および Kuma062/TAK-062 は、細菌 Alicyclobacillus sendaiensis 由来のセリンエンドペプチダーゼであるクマモリシンのコンピューター再設計によって開発されました 20。ただし、これらの候補者の中には、上記の要件をすべて満たすものはありません。現在の最有力候補物質は、胃内 pH 条件下では高い活性を示さず、および/または非常に高用量または PEG 化やマイクロカプセル化などの保護修飾を必要とします。したがって、臨床試験ではセリアック病患者の顕著な臨床的寛解はまだ達成されておらず、グルテンフリーの食事に代わるこれらの酵素の能力は実証されていません 12。さらに悪いことに、現在 CoD 栄養補助食品として店頭で販売されている多くのいわゆる酵素製剤は有毒なグルテンペプチドを不活化せず、したがってセリアック病にとって危険です 21。

ネプロシンは、未知のクラスとメカニズムの 380 残基のエンドペプチダーゼであり、現在 MEROPS データベース (www.ebi.ac.uk/merops22) ではファミリー U74 に割り当てられています。これは、捕食動物を水差しの中に閉じ込める食虫植物ウツボカズラの消化液中で発見された PEP です 23、24、25、26。この酵素は、獲物の消化および/または防御時のタンパク質代謝において機能している可能性があります23。消化液由来の他のペプチダーゼと組み合わせて、グルテナーゼ製剤の一部として使用される可能性があることが確認されています 24。精製ネプロシンもプロテオミクスに有用な試薬であると考えられています 25,26。

ここでは、高収率でネプロシンを生産するヒト組換え生産システムを確立します。私たちは、その活性化機構を in vitro で決定するとともに、その熱安定性、pH プロファイル、一般的なタンパク質分解活性およびペプチド分解活性、および一連のペプチダーゼ阻害剤に対する感受性を決定します。また、グリアジンと 33 量体の切断を in vitro でテストして、ネプロシンが単独のグルテナーゼとして作用する能力を評価します。さらに、マウスにおけるグリアジンのプロセシングに対する組換えネプロシンの影響を評価します。最後に、ネプロシンチモーゲンの結晶構造と、生成物模倣複合体におけるその成熟型を報告します。これらのデータは、潜伏機構、全体的および活性部位の構造、触媒機構、およびペプチダーゼのクラスを明らかにしており、これらは変異体のコホートによって検証されています。

ネプロシンに関するこれまでの研究では、大腸菌での異種発現では部分的に不純な酵素しか生産されず、収量も低かったため、主にピッチャー植物液から精製された酵素が使用されていました 24,25。私たちはこのアプローチを再現できなかったため、真核生物の翻訳後プロセシングが必要であると仮定して、ヒト細胞に基づいたシステムを開発しました。これにより、C 末端ヘキサヒスチジン (His6) タグ (41 kDa) を備えた約 10 mg/L、またはツインストレプトアビジン (Strep) タグ (43 kDa) を備えた約 8 mg/L の純粋なよく折りたたまれた完全長タンパク質が得られました (図1a、b)。このタンパク質は適切に折り畳まれ、中性緩衝液中4℃で数週間安定に保たれましたが、タンパク質分解活性を欠いており、これは全長タンパク質がプロネプロシンチモーゲンであるためであると考えられました。実際、強酸性緩衝液中でインキュベートすると、時間の経過とともに結合 P128 ～ S129 (上付きのネプロシンの残基番号付け; UniProt ID C0HLV2) で容易に自己分解成熟が起こり、ネプロシン触媒ドメイン (CD) と切除されたプロドメイン (PD) が得られました。）（図1e）。後者は最終的に分解され、校正されたサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）で確認すると、プロネプロシンとネプロシンの両方がモノマーとして移動しました（図1d）。

a His6 または (b) Strep タグアフィニティークロマトグラフィーによる野生型 (WT) プロネプロシンの精製。フロースルー (FT)、洗浄 (W)、および溶出 (E1 ～ E3) 画分を、分子量マーカー (レーン M) と並行して SDS-PAGE およびクーマシー染色によって分析しました。パネルは 3 つの独立した実験を表しています。 c His6タグアフィニティー精製後のプロネプロシン変異体（K118A、H134A、Y136A、Q173A、W175A、E188A、E188Q、Y214A、E297QおよびE297A）を（a）および（b）のWT型と比較しました。 2 つの独立した実験を表す図。 d Superdex 75 10/300 GL カラムで分離された His6 タグ付きプロネプロシン (マゼンタ)、Strep タグ付きネプロシン (緑)、および His6 タグ付きネプロシン (青) のサイズ排除クロマトグラフィープロファイル。各曲線には mL 単位の溶出量がラベル付けされており、すべての場合においてモノマーを表します。 e 酸性緩衝液中、37 °C でのプロネプロシンの経時的な自己分解成熟。 2 つの独立した実験を表す図。 f 酸性自己分解によるプロネプロシン変異体（Z レーン）の活性化（A レーン）、または Strep タグ付きネプロシンの添加によるトランス活性化（S レーン）。変異体 K118A (3 番目のパネル) は、アフィニティー精製後の事前活性化タンパク質として取得され、別々の PD バンドと成熟タンパク質バンド (レーン Z) が明らかになり、酸性バッファー中でのインキュベーションによって完全に活性化されました (レーン A)。 2 つの独立した実験を表す図。この図の個別のパネルについては、適切な場合、関連するソースデータがソースデータファイルとして提供されます。

Thermofluor アプローチを使用した示差走査蛍光分析 27 により、成熟酵素の中間転移温度 (Tm) が 68 °C であることが明らかになりました (図 2a)。これは、周囲温度範囲で機能するペプチダーゼとしては注目に値し、超好熱性酵素をより彷彿とさせます 28 。さらに、チモーゲンのTmは9℃高く（図2a）、PDが安定性を促進し、おそらく他のチモーゲンで報告されている完全長タンパク質の正しいフォールディングを促進することを示唆しています29。これは、同じ発現系を使用して成熟ネプロシン (PD なし) を発現できないことによって裏付けられました。最後に、還元剤の存在下でのサーモフルオル研究により、2つの遷移を伴うアンフォールディングプロセスが明らかになり、最初の遷移は42〜44℃で起こりました（図2b）。これは、以下でより詳細に説明するように、タンパク質を安定化するジスルフィド結合の存在を示しています。

a ネプロシン (暗赤色) とプロネプロシン (緑色) の熱変性中の温度依存性蛍光変化の二重曲線を示す示差走査蛍光分析。挿入された中間転移温度 (Tm) は、2 つのそれぞれの曲線の平均変曲点です。 b (a) と同じ。未処理のプロネプロシン (青) と比較した、5 mM (赤) および 10 mM (緑) での還元剤としての TCEP の効果を示しています。 c 蛍光 BSA 基質上のペプシン (赤)、トリプシン (緑)、およびネプロシン (青) の pH 依存性活性。ネプロシンの場合、データは平均値 ± SD (n = 3 回の独立した実験) です。トリプシンとペプシンの値は 1 回測定されました。 d、e 蛍光発生ペプチドのネプロシン媒介切断の動態 (d) FS6 (100 nM ネプロシン) および (e) FS6-QPQL (25 nM ネプロシン)。挿入図は、対応する Vmax、kcat、KM、および kcat/KM の値を示しています。 f 蛍光発生性FS6-QPQLペプチドに対する野生型（WT）ネプロシンおよび変異体のペプチド分解活性。統計的有意性は両側スチューデント t 検定によって決定されます (*p < 0.1; **p < 0.05; ***p < 0.001)。 *** が付いた 7 つのバーの p 値は、左から右に、0.0052、0.0050、0.0036、0.0036、0.0029、0.0033、0.0034 でした。 g 寄託データの再分析に基づいたネプロシンの基質優先性を示すロゴ 25。 h 試験分子または混合物の影響 (1) 1,10-フェナスロリン、(2) AEBSF、(3) ホスホルアミドン、(4) マリマスタット、(5) cOmplete、(6) BGP、(7) カプトプリル、(8) DAN、(9) BEOPC、(10) AMP、(11) ペプスタチン A、および (12) EPNP を WT 対照 (C) と比較しました。最後の 2 つの化合物のみが顕著な阻害を達成します。統計的有意性は両側スチューデント t 検定によって決定されます (*p < 0.1; **p < 0.05; ***p < 0.001)。 ** と * の付いた 2 つのバーの p 値は、それぞれ 0.0215 と 0.0698 でした。 i ペプスタチン A (左) および EPNP (右) の阻害活性のプロット。テスター濃度と導出された IC50 値を示します。パネル d ～ f、h、i については、データは平均値 ± SD (n = 3 回の独立した実験) であり、適切な場合は関連するソースデータがソースデータファイルとして提供されます。

比較のためにアスパラギン酸ペプチダーゼである胃ペプシンとセリンペプチダーゼである膵臓トリプシンを使用して、ネプロシンによる蛍光ウシ血清アルブミン（BSA）の切断に対するpHの影響を調査しました（図2c）。ネプロシンの最適 pH は 3 で、胃ペプシンの最適 pH (pH < 2) に近かった。対照的に、トリプシンの至適pHは8で、この値ではネプロシンとペプシンの両方が完全に不活性になります。以前に報告されているように、ペプシンは中性 pH で不可逆的に阻害されました 30 が、ネプロシンは pH 2.5 と 9.0 の間で切り替えることによって可逆的に活性化および不活化されました。さらに、ネプロシンは保存のためにpH 7.5で凍結または凍結乾燥しても影響を受けず、したがって、それぞれ酸性緩衝液中での解凍または再懸濁後にその完全な活性が回復した。最後に、ネプロシンは酸性 pH ではペプシンによる切断に対して鈍感でした。したがって、この活性、効率、安定性、堅牢性のプロファイルは、さまざまな条件下、正確には食虫植物の芽球の自然環境下で長期間にわたって機能しなければならない消化酵素と一致していました 31。

ネプロシンの基質特異性についてさらに洞察を深め、切断アッセイの指針を得るために、我々は、この酵素が本物のPEP25であると同定された、主に精製物質に基づいて公開されているプロテオミクスデータを再分析しました。我々は、P6〜P6 'にわたる3001のユニークな切断部位を発見し（基質および活性部位サブサイトの命名法は32、33に基づいています）、そのうち1863（62％）はP1のプロリン残基を特徴としていました（図2g）。プロリンも、P2 および P3' では天然存在量の 2 倍に濃縮されましたが、P1' および P2' では非常に不利でした。グルタミン酸とメチオニンは P2' で 3 倍濃縮され、アラニンは P6 ～ P6' 全体で容易に受け入れられ、グリシンは P1 ～ P3' で著しく嫌われました。これらのデータは、P1にプロリンを含む基質を強く好むこと、およびP6-P6'内の特定の位置が特定のアミノ酸には適していないことを明らかにしました（図2g）。

ペプシン単独と比較して、ペプシンの存在下および非存在下でネプロシンがグリアジンを消化する能力をSDS-PAGEおよび濁度測定により調査しました（図3a、b）。両方の酵素は、ペプシン 34 の生理学的閾値である約 5 μM 未満の濃度で別々にグリアジンを効率的に分解しましたが、両方の酵素を組み合わせると最適な結果が達成されました。注目すべきことに、ネプロシンの最適濃度は胃ペプシンの濃度と同様であり、現在のグルテナーゼ候補に必要な濃度よりも桁違いに低かった。ザイモグラフィーは、ネプロシンが同様の効率で、同じく食物タンパク質であるグリアジンとゼラチンを分解することを示しました（図3d、e）。

増加する濃度のペプシン (左)、ネプロシン (中央)、またはネプロシンとペプシン (右) に曝露されたグリアジンの SDS-PAGE 分析。 2 つの独立した実験を表す図。 b 比濁法によって測定された、(a) と同様のグリアジン切断を経時的に示す曲線。 c 上から下まで、33 mer ペプチド (3912 Da) の質量スペクトル。 0.5 μM ネプロシンと 0 分間、20 分間および一晩インキュベートした後の 33 量体ペプチド。ネプロシン単独。および 10 μM ペプシンと一晩インキュベートした後の 33 mer ペプチド。ペプチドは無傷のままです。 d ネプロシンの活性（左レーン）およびプロネプロシンの自己活性化から生じる成熟酵素（右レーン）を示すグリアジンザイモグラム。 e (d) と同じですが、ゼラチンザイモグラフィーを示しています。 f 赤い二重矢印で強調された 33 量体の配列と 6 つの重複する HLA-DQ2.5 結合エピトープの範囲 7。トランスグルタミナーゼによる脱アミド化を受けやすいグルタミンは紫色の円で示されています11。このペプチドは、α-グリアジンのセグメント L76 ～ F108 に対応します (UniProt ID P18573)。 g ネプロシンによる 33 mer ペプチドの切断は、時間の経過とともに 2 つの経路 (上と下) に従って進行します。この図の個別のパネルについては、適切な場合、関連するソースデータがソースデータファイルとして提供されます。

次に、トランスグルタミナーゼによって脱アミド化される 3 つのグルタミン残基と 6 つの重複する免疫原性 HLA-DQ2.5 T 細胞エピトープ 6、11、35 を含む 33 量体の切断を質量分析法によって調査しました（図 3f）。我々は、pH 3で20分後、250μMのペプチドが0.5μMのネプロシンにより500:1の比率で効率的に分解されることを発見した（図3c）。一晩インキュベートした後でも自己分解性切断産物は検出されず、酸性条件下での成熟酵素の安定性が確認されました。対照的に、ペプシンは、ネプロシンよりも 20 倍高い濃度で一晩インキュベートした後でもペプチドを切断できず、消化ペプチダーゼに対する 33 量体の耐性が確認されました。ネプロシンによって生成されたペプチド切断フラグメントの分析により、Q-L-P-Y-P-Q-P (843 Da) および L-Q-L-Q-P-F-P-Q-P ( 1068Da）。反応を経時的に監視することにより（図3g）、切断は33量体に存在する13個のうちの5つの特定のプロリン残基のすぐ下流、好ましくはP-Q-P*Q-L-Pでのみ発生し、常に発生することがわかりました。これは、無差別プロテオミクスから推定される P1 でのプロリンの単純な特異性を認定し、上で議論したように P2 の大きな疎水性残基 (ロイシン、フェニルアラニン、チロシン) が好まれないことと一致します。全体として、我々の結果は、33 量体が Q-P*Q-L モチーフを特徴とする複数の部位で分解されることを示しています。注目すべきことに、BSA には 2 つの P-Q ジペプチドと、同様に好まれる 5 つの P-E 部位 (上記参照) も存在しており、アルブミンが低 pH におけるネプロシンの基質として適切である理由が説明されています。

最後に、蛍光発生ペプチドのコホートの切断をテストしました。マトリックスメタロプロテイナーゼとアダマリシンの基質である P-L 結合 (Mca-K-P-L-G-L-Dpa-A-R-NH2) を含むペプチド FS6 が、次の式に従って中程度の効率で切断されることを発見しました。速度論的分析（kcat/KM = 765 M−1s−1;図2d）。対照的に、33 mer (Mca-Q-P-Q-L-Dpa-A-R-NH2) のネプロシン切断部位を含むように再設計されたペプチド変異体 FS6-QPQL は、主に 30 倍効率的に切断されました。 kcatの増加によるものです（kcat / KM = 23,880 M−1s−1;図2e）。したがって、ネプロシンは、胃のような条件下で 33 量体を効率的に分解する、P-X よりも特異性が制限された PEP として定義できます。

酵素の触媒クラスが不明であることを考慮して、次に、ネプロシンによるFS6-QPQL切断をブロックする能力についてペプチダーゼ阻害剤のパネルをテストしました（図2h）。また、我々は、プロリンを生成物とするピロリン-5-カルボン酸レダクターゼ 37 の阻害剤を見つけるために最近適用されたアプローチに従い、一連のプロリン含有/模倣化合物をテストしました。ペプスタチン A と 2-[(4-ニトロフェノキシ)メチル]オキシラン (EPNP) のみがネプロシンを弱いながらも有意に阻害し (図 2h)、最大阻害濃度の半分 (IC50) 値がそれぞれ 140 μM と 480 μM であることがわかりました。図2i)。ペプスタチンと EPNP 様エポキシドがネプロシンと配列類似性を持たないペプシン型アスパラギン酸エンドペプチダーゼの阻害剤であることを考えると、これは予想外のペプチダーゼの種類とネプロシンの触媒機構を示しています。

インビボでのネプロシンの活性を調べるために、非常に低い質量比(1:500 w/w)のチモーゲンまたはビヒクルのいずれかを投与した5分後に、マウスにグリアジンをボーラス投与した。 2.5時間後、3つの上部消化管セグメントの内容物を採取し、酵素免疫吸着法により33量体の濃度を測定しました（図4）。ペプチドは、処置された動物のすべての部分（61～91％）において実質的に少なく、全体では71％存在しなかった。したがって、不活性チモーゲンは胃に到達すると活性化され、生体内でのグリアジン (特に 33 量体) の分解を効率的に助けながら、生理的消化酵素に対する耐性を維持します。これは、候補グルテナーゼの濃度よりもはるかに低い濃度で、PEG化やマイクロカプセル化などの保護戦略なしで発生します。これらの結果は、感作された NOD/DQ8 マウスに、ペプシンであらかじめ消化されたグリアジンと、他の成分の中でも特にネプロシンとネペンテシンを含むウツボカズラのピッチャー液を与えた場合、炎症マーカーの有意な減少を示したという以前の研究と一致しています24。

ネプロシンチモーゲン (N) またはビヒクル (V) をボーラス投与する前に投与されたマウスの胃 (S)、近位小腸 (pSI) および遠位小腸 (dSI) の総内容物中の 33 量体 (μg) の量グリアジン。結果は平均値 ± SEM (1 グループあたり n = 8 匹の動物) です。統計的有意性は、片側 F 検定によって決定されました (*p < 0.05、N 対 B)。 p 値は、0.048 (S)、0.049 (pSI)、0.026 (dSI)、および 0.021 (合計) でした。関連するソースデータは、ソースデータファイルとして提供されます。

我々はプロネプロシンを斜方晶系空間群で結晶化し（図5aおよび補足表1）、ポリペプチドが生理学的成熟部位（P128〜S129）で切断されることを発見した。したがって、結晶には、切断されたPDとCDの酵素形成複合体が含まれていました（図5a）。 Lu-Xo440に浸した結晶からルテチウムLIII吸収端波長でデータを収集し、単一波長異常回折によって構造を解明しました（図5b）。この浸漬により、X 線の良好な回折を維持しながら、天然結晶と比較した場合、結晶セル軸の 1 つに大きな変化が生じました (補足表 1)。誘導体複合体の最終的に洗練されたモデルを使用して、分子置換によって天然のプロネプロシン構造を解明しました。さらに、成熟ネプロシンは 2 つの異なる単斜晶系結晶形 I および II (図 5a および補足表 1) を生成し、その構造も同様に分子置換によって解決されました。

a プロネプロシンの斜方晶系結晶 (左パネル) には、切断された PD (p) と CD (e) の複合体が含まれていました (中央左パネル)。成熟酵素結晶は単斜晶系でした（中央右パネル、結晶形 I; 右パネル、結晶形 II）。中央左パネルの実験は 1 回実行されました。 b プロネプロシンの構造は、ルテチウム誘導体を使用して解明されました。 1 つの部位 (左パネル) では、Lu3+ カチオン (緑色の球) は、2.40 ～ 2.65 Å の距離にある有機足場からの 2 つのカルボン酸酸素と 5 つの窒素原子およびタンパク質残基 E89 のカルボン酸酸素によって非配位されていました。 1.3 σ で輪郭を描いた導関数の最終的な (2mFobs-DFcalc) タイプのフーリエマップ (右パネル)。 c 正面（左パネル）および側面（右パネル）視点でのプロネプロシンのリボン型プロット。 PD は金色で、マゼンタのヘリックスがあります。成熟した酵素はサケに見られます。無秩序な/切断されたセグメントは灰色の破線で示されます。 N145 と N152 の 2 つのグリコシル化部位、7 つのシステイン、A60、および 2 つの触媒グルタミン酸 (E188 と E297) が側鎖として示され、標識されています。 2 つのグリカン鎖の周囲の最終的なフーリエマップは 0.6 σ で示されています。 d 鎖を矢印（β1〜β22と標識）、2つの短いヘリックス（α1およびα2）をマゼンタのロッドとしたプロネプロシンのトポロジー。各二次構造要素の末端残基が示されています。 PD は黄色の鎖とマゼンタのヘリックスを持ち、成熟酵素部分の前面シートはオレンジ色、背面シートは茶色です。 7 つのシステインはさらに緑色で示され、グリカンは緑色の菱形で示されます。触媒グルタミン酸塩は参考のためにマークされています。 e 上の行は、(c) のようなプロネプロシンの正面図 (左) と背面図 (右) を示し、どちらも PD を黄色のリボンとして、CD のクーロン面 (赤色、-10 kcal/mol) を示しています。 ·e; 青、+10 kcal/mol·e) Chimera85 で計算。成熟酵素成分の計算された pI は 4.3 です。下の行は、PD がクーロン面 (pI = 9.5) として示され、CD がサーモンリボンとして示されていることを除いて、同じものを示しています。

プロネプロシンは、約55×約45×約40Åのコンパクトな長方形の分子です（図5c）。 N 末端 PD (R25 ～ P128) は、A29 以降の最終フーリエマップで定義されており、球状部分 (A29 ～ G112) と、それに続く下流の CD (S129 ～ Q380) へのリンカー (L113 ～ P128) を特徴としています。切断された成熟部位を含むセグメント (N122 ～ N131) は柔軟性があります。 PDは、左端の鎖の挿入によって中央鎖が二分される、逆平行の3本鎖βシートを特徴としています（図5c、d）。右側の 2 本の鎖は上部の長いセグメントによって接続されており、このセグメントには 2 つの短い α ヘリックス、ジスルフィド結合 (C52 ～ C98)、および分子後部の無秩序な 10 残基セグメント (Y77 ～ N86) が含まれています。後者はおそらく、CD のバックストランド内の N152 に結合した突き出たグリカン鎖に起因すると考えられます (図 5c)。 2 番目のグリカンは、CD 上のクロスオーバーループから N145 に結合します。 PD の最後の鎖を越えると、鎖は 90° 回転して PD/CD リンカーに入り、CD の前面に沿って伸長した立体構造で進みます。

一般にα/βタンパク質41であるペプチダーゼの場合は異例ですが、CDは逆平行のβサンドイッチであり、強くカールした7本鎖のフロントシートと、前者の足場となる8本鎖のバックシートを備えています（図1）。 5c、d)。両方のシートは、サンドイッチの両側にある長いヘアピンβ12β13とさらに2つのジスルフィド結合（C219-C224およびC358-C379）を含む9つのクロスオーバーループによって相互接続されています（図5d）。これらすべての要素がコンパクトで頑丈な構造に寄与しており、これがネプロシンの優れた pH 安定性とペプシン消化に抵抗する能力の説明になっています。対照的に、ジスルフィド結合は構造に深く埋められていないため、還元剤に対する感受性が説明されています。成熟ネプロシン結晶形 I (補足表 1) の構造は、チモーゲンの等価部分と実質的に同一であることが判明し、コア二乗平均平方根偏差 (RMSD) は 0.62 Å でした。唯一の有意な違いは、PD の右端の鎖の先頭にある I103 を収容するためにチモーゲン内で外側に折り畳まれている N232-Y233 で見られました。一方、結晶形 II は、3.8 Å 離れたループ Lβ21β22 の先端と、結晶によって再配向された C 末端タグを除いて、結晶形 I (コア RMSD = 0.66 Å) と実質的に区別できませんでした。パッキング。したがって、キモトリプシン型セリンペプチダーゼを例外として、ほとんどのペプチダーゼに見られるように、成熟酵素成分は本質的にチモーゲン内で前もって形成されます 42、43、44。

我々は、他の酵素原に見られるように、活性部位の裂け目はPDリンカーによって描写されるのではないかと仮説を立てました（図6a）。さらに、成熟ネプロシン結晶形 I および II の構造では、アラニン - イソロイシン - アラニントリペプチドとそれに続く His6 タグにまたがる C 末端セグメントが対称結合体の表面に沿って伸びており、したがって生成物複合体を模倣しています。。どちらの結晶形も単斜晶系でしたが、セル定数が異なり (補足表 1)、その結果、結晶充填が変化しました。それでも、C末端タグは両方の結晶学的配置で同様の方法で亀裂を貫通しますが、3つの位置だけシフトしているため、結晶形IのH404〜H409は結晶形IIのA401〜H406と重なっています（図6b、c）。。したがって、ネプロシンは、フロントシートのβストランドの方向に対して〜55°斜めである、シートの凹面を横切る拡張した活性部位の裂け目を所有していると考えられます（図6a〜c）。

黄色の炭素と黒色の残基番号が活性部位の裂け目を横切る棒モデルとして最終フーリエマップで定義されたPDの最終セグメント（L113–P121）を示す図5cの拡大図。可能性の高い P1 および P1' ～ P3' 残基が標識されています。さらに、活性部位の選択された残基は、側鎖の炭素が黄褐色で示され、水色で番号が付けられています。触媒作用に関連する可能性がある 2 つの溶媒残留物が緑色の球として示されています。挿入図は、K118 と E188、Q173、および溶媒分子との相互作用 (マゼンタの線) を強調するために、わずかに回転させた拡大図を示しています。 b (a) と同じ。成熟ネプロシン (結晶形 I) の生成物複合体を示しています。A403 にまたがる対称メイトの C 末端尾部と His6 タグ残基 (H404 ～ H409) をシアンの炭素を持つスティックモデルとして示しています。基質サブサイト P6 ～ P1 を特徴とします。触媒作用に潜在的に関連する溶媒分子 (緑色の球) が E297 と E188 (マゼンタの棒) を架橋します。 c 結晶形 II の (b) と同じ。 A401 と His6 タグの一部 (H404 ～ H408) にわたる対称メイトの C 末端尾部は、プラムの炭素を持つ棒モデルとして示されており、おそらくサブサイト P6 ～ P1 ' をカバーしています。触媒作用に潜在的に関連する溶媒分子 (緑色の球) が E297 と E188 (マゼンタの棒) を架橋します。 2 番目の溶媒分子 (黄色の矢印) は、おそらくミカエリス錯体の切断可能なカルボニル酸素の位置を占めています。両方の結晶形のポリペプチド鎖は、それぞれの CD を重ね合わせると、タグ残基 H404 ～ H409 (結晶形 I) および A401 ～ H406 (結晶形 II) で重複します。 d P3〜P3 'の位置にある残基P – Q – P * Q – L – P（緑色の炭素）にわたる基質とネプロシンの活性部位の間のおそらくミカエリス複合体のモデル。選択した残基は側鎖 (プラムカーボン) として表示され、ラベルが付けられます。触媒溶媒はシアン色の球として示されています。 e ネプロシンによる基質切断の化学機構の提案。

可能性のある触媒残基の探索において、私たちは機能的に類似したペプシン型アスパラギン酸ペプチダーゼにインスピレーションを受けました。これらのペプチダーゼは、構造が異なるにもかかわらず、同様に主にβタンパク質であり、高酸性の pH45 で作動します。さらに、我々が発見できた唯一の（弱い）ネプロシン阻害剤は、アスパラギン酸ペプチダーゼを阻害することも知られています（上記参照）。これらの酵素は、触媒作用のために溶媒分子によって架橋された一対のアスパラギン酸残基を使用します46。実際、我々は、生成物複合体中の結合ペプチドを挟む溶媒分子によって架橋されたグルタミン酸残基の印象的なペア（E188およびE297）を発見した（図6b、c）。結晶形 II では、明確に分離された第 2 の溶媒分子が、基質の切断しやすいカルボニル酸素を置き換えます (図 6c)。グルタミン酸ペアは、わずかに離れていましたが、チモーゲン構造内で同様に配置されていました（図6a）。したがって、我々は、テストのために、His6タグ付きプロネプロシンのE188Q、E188A、E297QおよびE297A点変異体を作製した（図1c）。これらの変異体は、酸性pHでインキュベートしても自動活性化されなかったため（図1f）、触媒量の成熟Strepタグ付き野生型ネプロシンを使用して、トランスで活性化が引き起こされました。最後に、E188QおよびE297Q変異体の十分に折りたたまれた完全な成熟変異体を取得しましたが、E297AまたはE188Aは得られませんでした（図1f）、そしてこれらは実際に触媒的に不活性でした（図2f）。したがって、E188 と E297 は触媒ダイアドとして機能する可能性があり、ネプロシンが (アスパラギン酸ペプチダーゼとは対照的に) あまり研究されていない触媒クラスであるグルタミン酸ペプチダーゼであることが明らかになります 47。これは、バイオインフォマティクス研究に基づいたごく最近の予測と一致していますが、実験的には検証されていません48。我々の結果は、成熟ネプロシンの構造がサブサイトS6からS1'を集合的に占める上流の生成物複合体を模倣しており（図6b、c）、2つの触媒グルタミン酸塩と架橋溶媒分子が反応の準備を整えていることを示唆しています。 PDリンカーがチモーゲンの裂け目の右側のさらなる残基まで伸長すると(図6a)、これらはP3'までの位置に対応すると考えられます。したがって、S3'を超えた裂け目内の余分な空間と合わせて、ネプロシンはおそらく最大11のサブサイト(S6-S5')に及ぶ拡張された裂け目を特徴とし、これは切断結合を超えて拡張されたペプチドの必要性を説明している(上記を参照)。

基質複合体が存在しない場合、チモーゲンおよび生成物複合体模倣構造に基づいて、P-Q-P*Q-L-Pペプチドとネプロシンのミカエリス複合体のモデルを構築しました（図6d）。このモデルにより、潜在的な結合機能または触媒機能を持つ触媒グルタミン酸の近くにさらなる残基が存在することが明らかになりました。したがって、残基H134、Y136、Q173、W175およびY214（図6a〜d）をアラニンで置換することにより変異させ、対応するタンパク質を精製しました（図1c）。上で議論したように、すべての変異体はトランスでの活性化を必要としました（図1f）。 H134A、Y136A、およびY214Aの活性は野生型酵素より約80%低かったのに対し、変異体Q173AおよびW175Aは完全に不活性でした（図2f）。我々は、H134、Y136、Y214は触媒作用に関連しているが重要ではなく、おそらく触媒機構において補助的な役割を果たしているのに対し、Q173とW175は必須であると結論付けています（以下を参照）。

PD は成熟酵素の左側に横方向に付着し、その中央の β シートが前面シートの平面から約 90 度回転します。ドメイン間表面の界面形成時の無溶媒和エネルギー利得 (ΔiG) は -25.8 kcal/mol49 であり、非常に強い相互作用を示しています。さらに、この複合体は 2176 Å2 を埋め込み、これはタンパク質間複合体の報告されている平均値 1910 Å2 を超えています 50。 PD（理論的pI = 9.5、図5e、下）は三日月形であり、静電補完下でCD（pI = 4.3、図5e、上）をぴったりと包み込み、これは活性抑制とチモーゲンの安定性に寄与します（pI = 5.9） ) 中性またはわずかに酸性の pH 値。さらに、密接な酵素形成相互作用は、サーマルシフトアッセイにおけるプロネプロシンの顕著な安定性をさらに説明します（上記を参照）。最後に、PDの重要性は、界面を不安定にするように設計された点変異体A60Rをテストすることによってさらに評価されました（図5c、左パネル）。この突然変異により、折りたたまれたタンパク質の単離が妨げられました。

酸性の消化液に分泌されると、負に帯電した残基のプロトン化により正味の正電荷が反発され、チモーゲンはあらかじめ形成された成熟部分と活性部位の裂け目の遊離により分解します。裂け目の S1 位置は、pH 7.5 で得られたチモーゲン構造内の PD リンカーの K118 によって占められています。この残基は触媒 E188 と強力な塩橋を形成し、Q173Nε2 と水素結合を形成します。これは必須です (上記および図 6a、挿入図を参照)。したがって、我々は、効率的に過剰発現されるが、野生型酵素および他の変異体が無傷のままである条件である中性緩衝液中で部分的な自己分解成熟を受ける変異体K118Aを作製およびテストした（図1c）。その後の pH 2.5 でのインキュベーションにより、活性化プロセスが完了しました (図 1f)。予想通り、成熟変異体の活性は野生型酵素の活性と同様でした(図2f)。

上記に基づいて、我々は、K118-E188ペアは、pHスイッチ機構に従ってチモーゲンが酸性環境に達すると弱まる可能性がある潜在プラグを特徴とし、その結果、成熟切断のためにPDリンカーが引き抜かれると提案する。これは、K11843,51 と機能的に同等のリジン残基を特徴とする消化性アスパラギン酸ペプチダーゼのペプシンおよびガストリシン、およびリソソームペプチダーゼのレグマイン 52 を思い出させます。 pHスイッチ機構と、切断可能なP1'-P1ペプチド結合がY214側鎖に挟まれているため、切断にアクセスできないという事実（図6a）は、なぜチモーゲンリンカーが次の方向に結合できるのかを説明しています。中性 pH で基板が切断されることなく割れ目に到達します。これは、消化性アスパラギン酸ペプチダーゼを含むほとんどのチモーゲンとは対照的であり、プロセグメントは、不用意な活性化を防ぐ機構として非基質様の方法で成熟酵素残基と相互作用します42、43、44。最後に、裂け目の切断結合位置は K118 ～ Q119 によって占められているが、成熟は P128 ～ S129 で起こることを考えると、PD リンカーが裂け目から解放されると、おそらく 2 番目の酵素分子によって活性化がトランスで起こると考えられます。

上記の結果に基づいて、ネプロシンの触媒的切断機構は次のように進行すると考えられます。生成物複合体中のE188およびE297カルボキシレートを架橋する溶媒は、基底状態の触媒水を表す（図6e、ステップI）。この水は E297 に近く、ペプシン型酸性ペプチダーゼの 2 つの触媒アスパラギン酸塩の 1 つについて報告されているように、E188 がプロトン化されている可能性があることを示唆しています 46。 E297 は H134Nε2 および Y136Oη との水素結合によって所定の位置に維持されますが、E188 は Y214Oη、T186Oγ および Q173Nε1 との水素結合によって所定の位置に維持されます。反応中、基質は拡張立体構造で活性部位の裂け目に結合し（図6e、ステップII）、裂け目のS3、S1、およびS3'サブサイトはY194、Q192、およびF169によって形成されます。 Y208、Y206、L171、E188、Q173。それぞれY136、W175、E293であり、プロリンの収容に理想的です（図6d）。基質主鎖は、そのカルボニルとP3のY220Oη、P2のH134Nε2（基質結合によるχ2周りの180度回転によって可能）、およびP1 'のY136Oη間の水素結合によって固定されます（図6d）。基質の挿入により、触媒溶媒はさらに E297 に向かって移動し、一般的な塩基として作用し、そこからプロトンを引き抜いてその求核性を強化します。プロトン化されたE188カルボキシレートは、今度は切断しやすいカルボニル酸素と結合します（図6d、e）。その後、分極した溶媒は、切断しやすいカルボニル炭素のsi面に求核攻撃を実行し、その結果、四面体ジェムジオラート反応中間体が生成されます（図6e、ステップIII）。後者は、オキシアニオンホールの重要な役割において不可欠な W175Nε1 と Q173Nε1 によって安定化されると考えられます 53。その後、中間体は切断されやすい C-N 結合を切断することによって分解されます。この段階では、E297 は一般的な酸として作用し、新しい α-アミノ窒素をプロトン化します (図 6e、ステップ IV)。最後に、2 つの切断生成物が裂け目を離れ、酵素は新たな触媒作用の準備を整えます。

ペプチダーゼは当初、セリン、システイン、スレオニン、アスパラギン酸、および金属依存性ペプチダーゼの 5 つの機構クラスに割り当てられていました 54。 2004 年に、創始的なグルタミン酸ペプチダーゼ、すなわちデマチス科真菌 Scytalidium lignicolum 由来のシタリドカルボキシルペプチダーゼ B (SCP-B) が構造的に特徴付けられました 55,56,57。それ以来、密接に関連したアスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ (SCP-B と約 50% 同一) のみが構造的に分析されており 58,59、他の 7 つは機能的に評価されており、そのほとんどは真菌由来のものである 60,61,62,63,64 が、1 つは細菌由来のものである 65 。これらは MEROPS データベースではファミリー G1 に割り当てられており、非公式にはペプスタチン非感受性真菌カルボキシルペプチダーゼグループ 66 またはエクオリシン 55 として知られています。これらは、酸性条件下で機能する好熱性かつペプスタチン非感受性の酵素であり65、溶媒分極性一般塩基として作用する触媒性グルタミン酸塩を特徴とする。これはSCP-BのE190である（全長に従った下付きの残基番号付けについてはUniProt ID P15369を参照）一般的に使用される成熟酵素の番号付けには 54 を引きます 55,56)。グルタミン酸はグルタミン (SCP-B の Q107) によって補助されるため、エコリシンというファミリー名が付けられています。これらの残基はファミリー内で不変であり、非常に類似した残基が隣接しています 66、67。

典型的なSCP-Bは、ネプロシンCDとの全体的な類似性を示す7+7逆平行βサンドイッチです（図7a）。ネプロシンと結合した成熟型の SCP-B (タンパク質データバンク [PDB] ID 2IFR56) を重ね合わせると、その酵素形成構造は不明ですが、140 個の整列した残基が存在し、コア RMSD が 3.0 Å とかなり大きく、配列同一性がわずか 11% であることが明らかになりました。。接続ループと活性部位には顕著な違いがあり、例えば、ネプロシンのβ16に相当するβ鎖に続く真菌酵素に挿入された大きなジスルフィド結合した突出βヘアピンが存在する（図7a）。活性部位内で唯一保存されている残基は触媒グルタミン酸 (ネプロシンの E297 および SCP-B の E190) と触媒助剤の位置 (ネプロシンの E188 および SCP-B の Q107) であり、これにより可変性が生じます。異なる基質軌道と表面プロファイルを持つ活性部位の裂け目（図7b、c）。さらに、SCP-Bの交差変異体Q107EとネプロシンのE188Qは、互いの触媒二分子を模倣しており、上で議論され68で報告されているように、完全に不活性です。これは、SCP-B ではインスリンの F-F、L-Y、および F-Y 結合の切断を引き起こすが、プロリン隣接結合の切断は引き起こさない、さまざまな基質特異性を説明しています68。

a ネプロシン (鮭) と SCP-B (淡い青色) の Cα 痕跡をステレオで重ね合わせたもの。それぞれの触媒残基が棒で示され、ラベルが付けられています (①、ネプロシン/SCP-B の E297/E190、②、E188/ネプロシン/SCP-BのQ107)。活性部位の裂け目を覆うSCP-Bの独特のフラップ(赤い矢印)に注目してください。 N末端とC末端を示します。 b (a) の方向のコノリー面で示されたネプロシンの活性部位の裂け目の拡大図。 2 つの触媒残基が示されています (緑色のパッチ)。 c SCP-B の (b) と同じ。

現在のグルテナーゼは、CoD に対する効率的な経口酵素療法の厳しい基準を満たすには限界があります。ここで、我々の in vitro および in vivo 研究は、組換えネプロシンが、研究室でシミュレートされた胃条件下およびマウスの胃内でグリアジンとその 33 量体を非常に効率的に分解する強力なペプシン耐性酵素であることを示しました。したがって、低用量の酵素は消化中に胃ペプシンを補います。私たちの結果は、33 mer の Q-P*Q-L モチーフが容易に切断され、グリアジン特異的 T 細胞の分裂を刺激するには小さすぎるペプチドを生成することによって、重複する 6 つの免疫原性エピトープをすべて除去することを示しています 69。模擬胃条件下での in vitro でのネプロシンの切断効率は、他のグルテナーゼの切断効率よりも桁違いに高くなります 18、20、24、70、71、72。チモーゲンは中性 pH で生成され、この pH では安定性が保たれ、輸送や保存のために凍結乾燥できます。胃内で摂取された後にのみ活性化され、グルテンの有毒成分を切断します。胃食塊が食後のpHがわずかに酸性の十二指腸に排出されると、十二指腸は再び不活性になります。したがって、ネプロシンは、グルテン過敏症に対するさらなる治療開発の非常に有望な候補です。

変異体と活性アッセイに裏付けられた構造的および機能的研究により、ネプロシンがペプスタチン感受性PEPであり、高等真核生物に見られる唯一のグルタミン酸エンドペプチダーゼであることが同定されました。これは、他の点では無関係なペプシン型酸性エンドペプチダーゼのアスパラギン酸塩に類似した、これまで記載されていない一対の触媒グルタミン酸塩を特徴としています。ネプロシンは、強酸性の自然環境であるピッチャー植物の消化液でのみ活性化されるチモーゲンとして生成および分泌されます。成熟は、リジン媒介の潜伏プラグを解放する pH スイッチ機構に従います。

最後に、ネプロシンはペプスタチン感受性ですが、グルタミン酸 - グルタミンダイアドを持ち、原型 SCP-B で表されるエクオリシンファミリーのペプスタチン耐性グルタミン酸ペプチダーゼと全体的なフォールドを共有しています。ただし、PD と CD のサイズ、活性部位環境、基質結合様式と特異性、触媒作用の化学機構には違いがあります。さらに、エクオリシンは真菌と細菌に限定されているのに対し、約 35 ～ 40% の配列同一性を持つ潜在的なネプロシンオルソログは、グルテン含有作物を含む植物で広く見つかっています (そしてそれらに限定されています)。これは、他のタンパク質について以前に記載されているように、ネプロシンファミリーが細菌または真菌から植物への水平遺伝子伝達によってSCP-B祖先に由来した可能性があることを示唆しています74。転移の後には、植物界内で分岐進化が起こり、触媒残基の1つと中央のβサンドイッチを装飾するループが新しい基質に適応するように修飾されたと考えられる。エクオリシンとの類推により、ネプロシンファミリーのメンバーはエライシンと名付けられる可能性があります。

ウツボカズラ × ベントラタ由来の野生型ネプロシンをコードする合成遺伝子は、ウツボカズラアラタ由来のオルソログ (UniProt ID A0A1L7NZU4) と 91% 同一です。GenScript によってベクター pET-28a(+) に挿入され、ベクター pET-28a(+ )-proNEP (プラスミドとプライマーについては、補足表 2 を参照)。コード配列をベクターpCMVに移し、ベクターpS6-proNEPを生成した。これによりアンピシリン耐性が付与され、C 末端ヘキサヒスチジン (His6) タグが付加されました。コードされたタンパク質は、本明細書ではプロネプロシンとして記載される。同じプラスミドをアニーリングされたオリゴヌクレオチドクローニングによって修飾して、(a) プロネプロシンストレプト発現のために His6 タグをツイン Strep タグ (pS6-proNEP-Strep) に置き換え、(b) PD (pS6) を除去しました。 -NEP) ネプロシン CD (S129–Q380) と C 末端 His6 タグの発現用。 QuikChange 部位特異的変異誘発キット (Stratagene) または逆 PCR ベースの部位特異的変異誘発を使用して、点変異 A60R、K118A、H134A、Y136A、Q173A、W175A、E188A、E188Q、Y214A、E297Q を持つ pS6-proNEP の変異体を生成しました。そしてE297A。プラスミドを GeneJET Plasmid MaxiPrep Kit (Thermo Fisher Scientific) で精製し、構築物を DNA シークエンシングによって検証しました。

pS6-proNEP、pS6-proNEP-Strep、および pS6-NEP プラスミドによってコードされるタンパク質、ならびに 11 点変異体を、Multitron セルシェーカーインキュベーター (Infors HT) で増殖させたヒト Expi293F 細胞 (ThermoFisher Scientific) における過剰発現について評価しました。 37℃で。細胞にプラスミド DNA をトランスフェクトし、数日後にタンパク質精製のために回収しました。細胞馴化培地を遠心分離によって除去し、イミダゾールを補充し、ニッケル-ニトリロ三酢酸 (Ni-NTA) 樹脂 (Invitrogen) とともにインキュベートし、バッチアフィニティークロマトグラフィー精製 (AC) に供し、20 mM イミダゾールを含む緩衝液で十分に洗浄しました。タンパク質は、300 mM イミダゾールを含む同じ緩衝液で溶出されました。プロネプロシンストレプトマイシンの場合、Ni-NTA 樹脂を Strep-Tactin XT Superflow 懸濁液樹脂 (IBA Life Sciences) に置き換え、タンパク質を 50 mM d-ビオチン (VWR Life Science) を含む緩衝液で溶出しました。タンパク質を含む画分をプールし、濃縮した後、ÄKTA Purifier 液体クロマトグラフィーシステム (GE Healthcare) に接続された Superdex 75 10/300 GL カラム (GE Healthcare) でサイズ排除クロマトグラフィー (SEC) を行いました。

タンパク質は、Ｖｉｖａｓｐｉｎフィルター装置（ＳａｒｔｏｒｉｕｓＳｔｅｄｉｍＢｉｏｔｅｃｈ）での超遠心分離によって濃縮した。おおよそのタンパク質濃度は、BioDrop-DUO Micro Volume (Biochrom) を使用して 280 nm (A280) での吸光度を測定し、適切な理論上の吸光係数を適用することによって決定されました。さらに、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）とその後のクマシー染色（Thermo Fisher Scientific）によってタンパク質の純度を評価しました。タンパク質の同一性は、Centro de Investigaciones Biológicas (スペイン、マドリード) のタンパク質化学サービスおよびプロテオミクス施設で、それぞれペプチド質量フィンガープリンティングおよび N 末端エドマン配列決定によって決定されました。最後に、成熟野生型ネプロシンを凍結乾燥し、-20 °C で保存し、Milli-Q 水に溶解して再構成しました。

活性アッセイでは、野生型ネプロシンと点変異体の濾過馴化培地に 3 mM 還元グルタチオンと 0.3 mM 酸化グルタチオンを補充し、20 mM Tris・HCl pH 8.0 で pH を調整し、混合物を cOmplete とインキュベートしました。 His-Tag 精製樹脂 (Roche)。樹脂をオープンカラムに収集し、結合タンパク質を10 mM Tris・HCl pH 7.0、300 mM 塩化ナトリウムで洗浄し、次いで100 mM グリシン pH 2.5、300 mM 塩化ナトリウムで溶出した。

ネプロシンまたはネプロシン連鎖球菌の野生型および変異成熟型は、自己消化によって得られました。 Ni-NTA または Strep-Tactin カラムから溶出したタンパク質サンプルを緩衝液に対して透析し、100 mM グリシン pH 2.5 で 2 倍に希釈し、37 °C で最大 16 時間インキュベートしました。還元/変性SDSサンプルバッファー中でアリコートを沸騰させ、続いてSDS-PAGEを行うことにより、反応を特定の時点(0分、10分、20分、30分、1時間、2時間および一晩)で停止させた。成熟ネプロシンをPD10カラムで20mM Tris・HCl pH 7.5、250mM塩化ナトリウムに緩衝液交換し、続いて同じ緩衝液を用いてSuperdex 75 10/300 GLカラムでSECを行った。タンパク質の純度および同一性を上記のように評価しました。

自己活性化しないチモーゲンから成熟ネプロシン点変異体を取得するために、精製したプロタンパク質 (H134A、Y136A、Q173A、W175A、E188A、E188Q、Y214A、E297Q、および E297A) を 20:1 の重量で活性化ネプロシン-strep とインキュベートしました。 37℃で一晩の比率。プロネプロシンストレプトマイシンは、活性化のために事前に100 mM グリシン pH 3.0、150 mM 塩化ナトリウムに緩衝液交換されていました。切断されたサンプルをバッファー交換し、逆アフィニティークロマトグラフィーで精製し、濃縮して SEC で精製しました。

プロネプロシンおよび成熟ネプロシンは、iCycle iQ リアルタイム PCR 検出システム (Bio-Rad) を使用した示差走査蛍光分析によって分析されました。サンプルは、還元剤として 5 または 10 mM トリス(2-カルボキシエチル) ホスフィン (TCEP) の存在下または非存在下で 0.5 mg/mL で調製し、5 × SYPRO Orange Protein Stain (Thermo Fisher Scientific) を補充しました。中間転移温度 (Tm) は、安定性曲線の中点値の二重測定の平均として決定されました。

10 μM の蛍光タンパク質基質 DQ Red BSA (Thermo Fisher Scientific) を 0.15 μM ネプロシンとともに、pH 2 ～ 8 の 100 μL バッファー中でインキュベートしました。蛍光は、Infinite M2000 マイクロプレート蛍光計 (Tecan) を使用して 37 °C でモニタリングしました。比較のために、0.5 μM ウシトリプシン (Sigma-Aldrich) とブタペプシン (Fluka) をテストしました。各アッセイは三連で実施した。

野生型ネプロシン (最終酵素濃度 25 nM) による FS6-QPQL ペプチド (Mca-Q-P-Q-L-Dpa-A-R-NH2; GenScript) 切断の速度論パラメーター、および FS6 の速度論パラメーター最終酵素濃度 100 nM のネプロシンによるペプチド (Mca-K-P-L-G-L-Dpa-A-R-NH2; Sigma-Aldrich) は、100 mM グリシン、pH 3.0、基質濃度 1 を含む反応で測定されました。 37 °C で –75 μM (FS6-QPQL) または 2.5 ～ 75 μM (FS6)。切断生成物の形成を表す蛍光シグナルを各基質濃度について経時的に記録し、初速度 (v0) を曲線の直線部分の傾きから導き出しました。ある範囲の基質濃度と余剰のペプチダーゼを使用して、完全な基質代謝回転後に生成される蛍光シグナルを測定し、切断された基質のピコモルあたりの対応する蛍光単位を計算しました。これらの値を基質濃度に対してプロットし、GraphPad75 と SigmaPlot76 を使用した非線形回帰によって双曲線ミカエリスメンテン方程式 (v = Vmax·[S]/{KM+[S]}) に当てはめて、最大速度 (Vmax)、ミカエリス速度を決定しました。基質親和性定数 (KM)、ターンオーバー速度 (kcat = Vmax/[Etotal])、および切断反応の触媒効率 (kcat/KM)。すべての実験は 3 回繰り返して実行されました。

100 mM グリシン pH 3.0 中の 10 μM の蛍光発生 FS6-QPQL ペプチドを使用して、野生型ネプロシンのペプチド分解活性を変異体 K118A、H134A、Y136A、Q173A、W175A、E188Q、Y214A および E297Q (140 ng) のペプチド分解活性と比較しました。、150 mM 塩化ナトリウム、37 °C、Synergy H1 マイクロプレートリーダー (BioTek) 内で振盪。同一のサンプル処理を保証するために、すべてのタンパク質変異体をネプロシン-ストレプトマイシンで活性化し、次に上記のように逆アフィニティークロマトグラフィーによって除去しました。タンパク質濃度は A280 SEC 曲線の表面から推定され、ε280 値に基づいて補正されました。 30分後の蛍光値を活性エンドポイントとして使用した。実験は 3 回実行され、GraphPad を使用して差異が統計的有意性について分析されました。

小麦グリアジン (Sigma-Aldrich) を、100 mM グリシン pH 2.5 およびブタ胃粘膜 (Fluka) からのさまざまな濃度のペプシン (0.05 ～ 10 μM)、ネプロシン (0.05 ～ 2 μM)、または 0.5 μM ペプシンと 0.05 μM の混合物中で調製しました。 –2 μM ネプロシンを使用して 10 mg/mL のグリアジンスラリーを消化しました。反応は、マイクロプレート分光光度計 (BioTek) を使用し、37 °C で 96 ウェルプレート (Corning) で濁度測定によってモニタリングしました。 SDS-PAGEによる分析の前に、SDSサンプルバッファー中で沸騰させることによって反応を停止させました。ネプロシンによるグリアジン分解も、小麦グリアジンまたは硬骨骨ゼラチン (Sigma-Aldrich) を 0.1 mg/mL で対照として使用した SDS-PAGE ゲルを使用したザイモグラフィーによって分析されました。プロネプロシンもテストされ、アッセイ中に成熟型に活性化されました。タンパク質は、100 mM グリシン pH 2.5、200 mM 塩化ナトリウム中の2.5% Triton X-100でザイモグラムを洗浄することによって再生されました。 0.02% Brij-35を加えた同じ緩衝液でさらに洗浄した後、ザイモグラムを同じ緩衝液中で一晩インキュベートし、水で簡単にすすぎ、クーマシーで染色した。

小麦 α-グリアジンの 33 量体ペプチド (LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF、3911 Da) の切断を、AutoFLEX III MALDI-TOF 質量分析計を使用してモニタリングしました。ペプチド (GenScript 製) を水に約 20 mg/mL の濃度で溶解し、-20 °C で保存しました。切断反応は、0.5 μM ネプロシンまたは 10 μM ペプシンを添加することにより、100 mM グリシン pH 3.0 中の約 1 mg/mL (約 250 μM) 基質を用いて 37 ℃で実行されました。反応をさまざまな時点 (0 分、10 分、20 分、45 分、1 時間、一晩) で停止し、サンプルを水で 1:10 に希釈し、等量の 2,5-ジヒドロキシ安息香酸マトリックスと混合しました。３０％アセトニトリルおよび７０％０．１％トリフルオロ酢酸を含む溶液中に１０ｍｇ／ｍＬで溶解し、研磨鋼板（Ｂｒｕｋｅｒ）上にスポットした。質量スペクトルは、総加速電圧 21 kV で正のリフレクトロンモードで取得しました。

我々は、コーラスに寄託された内因性ネプロシンまたは大腸菌から得られた組換え材料の切断特異性データを再分析しました (プロジェクト ID 126225)。 LC-MS/MS 生ファイルは MGF 形式に変換され、データは SearchGUI77 に実装されている TANDEM、Comet、および MS-GF+ を使用して処理されました。結果は、PeptideShaker78 を使用して誤検出率 1% で評価されました。データは、MS1 と MS2 の両方について 20 ppm の質量許容値、固定システインカルバミドメチル化、および可変メチオニン酸化を使用して、UniProt (2020 年 3 月) でヒトプロテオームに対するヒットを非特異的に検索しました。親ペプチド質量については、最大 50 回の切断ミスまたは最大 5500 Da が許容されました。

ネプロシン阻害剤の探索において、我々は広域スペクトルの cOmplete Inhibitor Cocktail (Roche) をアッセイしました。メタロペプチダーゼ阻害剤の 1,10-フェナスロリン、ホスホルアミドン、マリマスタット、およびカプトプリル (すべて Sigma-Aldrich 製)。セリンペプチダーゼ阻害剤 4-(2-アミノエチル)-ベンゼンスルホニルフルオリド (AEBSF; Sigma-Aldrich)。アスパラギン酸ペプチダーゼ阻害剤ペプスタチン A (Sigma-Aldrich)、メチル-2-[(2-ジアゾアセチル)アミノ]ヘキサン酸 (DAN; Chemical Abstracts Service (CAS) 7013-09-4; Bachem 4010441)、および ENPN (CAS 5255-) 75-4; アポロサイエンティフィック OR26560); 同様に、プロリン含有/模倣化合物 2-アセチル-1-メチルピロール (AMP; CAS 932-16-1; Sigma-Aldrich 160865)。 (S)-tert-ブチル-2-(3-エトキシ-3-オキソプロパノイル)ピロリジン-1-カルボキシレート (BEOPC; CAS 109180-95-2; Fluorochem 387901); および N-boc-グリシルプロリン (BGP; CAS 14296-92-5; Bachem 4003703)。 FS6-QPQL ペプチドの切断の阻害は、100 mM グリシン pH 3.0 中の 100 nM ネプロシンを 100 μM の各テスター化合物とともに 37 °C で 1 時間以上プレインキュベートすることによって調査されました。次に、10 μM の基質を添加し、残留活性を蛍光の増加として 4 時間監視しました。 GraphPad を使用して、統計的有意性について差異を分析しました。阻害剤が存在しないポジティブコントロール（活性100％）には、阻害剤を可溶化するために使用したのと同じ最終濃度のジメチルスルホキシドが含まれていました。さらに、ペプスタチン A および ENPN の最大半数阻害濃度 (IC50) 値は、10 μM の基質および阻害剤濃度それぞれ 5 ～ 500 μM および 5 ～ 5000 μM の存在下で 50 nM ネプロシンの活性を測定することによって決定されました。、阻害曲線を取得します。これらの曲線は、GraphPad を使用した非線形回帰によって分析されました。

マウスを使用する実験手順は、実験動物の管理と使用に関する施設のガイドラインと ARRIVE ガイドラインに従いました。プロトコルは、バルセロナ大学動物実験倫理委員会 (CEEA-UB/Ref. 186/20-P2) およびカタルーニャ政府 (PAMN/Ref. 11485) によって承認され、次の指令 2010/63/EU に従いました。科学的目的に使用される動物の保護。サンプルサイズは、エルクス大学ミゲルエルナンデス大学 (スペイン、アラカント) の評価プロジェクトオフィスのプログラムによって推定されました。ジャンビエから購入し、バルセロナ大学薬食品科学部の動物施設で管理された環境（20〜24° C、相対湿度 40 ～ 60%）、日長 12 時間、午前 8 時に点灯、午後 8 時に消灯動物は、寝具として大きな Souralit 1035 繊維粒子（Bobadeb）とティッシュペーパー（Goma -キャンプ）とケージを強化するための段ボール製のクライミング構造。動物には水とRM3(P)SQC食(特別食サービス)を自由に摂取させた。

１週間の順応後、それぞれ雄４匹と雌４匹からなる２群のマウスをランダムに選択し（各群ｎ＝８）、ネプロシン（Ｎ）またはビヒクル（Ｖ）でマークした。生理学的通過時間を考慮して動物は絶食されず、強制経口投与の 1 時間前にのみ餌と水が除去されました。グループＮのマウスにはビヒクル中のプロネプロシン５０μＬ（２０μＭトリス緩衝生理食塩水ｐＨ７．５、１５０μＭ塩化ナトリウム中０．２ｍｇ／ｍＬ）を与えたが、グループＶのマウスにはビヒクル５０μＬのみを与えた。 5分後、小容量のハミルトンシリンジおよび適合した経口プローブを使用して、すべてのマウスに、10％エタノール溶液中に100 mg/mLで5 mgのコムギグリアジン（Sigma-Aldrich）を含む50 μLのグリアジンスラリーを与えた。酵素:グリアジン比 (1:500) は、ネプロシンが 37 °C で 90 分間にわたって 1:500 ～ 1000 の比でグリアジンを消化することを示した in vitro 結果に基づいて計算されました。マウスの消化管通過により、食塊は 1 ～ 3 時間後に小腸に到達し、一部の内容物はすでに大腸に入っている 79 ことを考慮して、上部消化管におけるグリアジンの分解を評価するための最適なエンドポイントとして 2.5 時間を選択しました。その後、動物を頸椎脱臼により安楽死させ、胃、近位小腸、遠位小腸の内容物を取り出して重量を量り、-20 °C で冷凍しました。

サンプルをリン酸緩衝食塩水 (pH 7.2) に 200 mg/mL の濃度で懸濁し、Kimble Pellet Pester コードレスモーター (DWK Life Sciences) でホモジナイズし、最初に緩衝液で 50 °C で 40 分間抽出し、次に緩衝液で抽出しました。 80% エタノール、20 ～ 25 °C で 1 時間。混合物を遠心分離し（2000×g、10分間、4℃）、粒子層と脂肪層の間の水層を除去した。各希釈抽出物中の 33 量体含有量は、製造元の指示に従って、検出限界 2 ppm の AgraQuant グルテン G12 ELISA テストキット (Romer Labs) を使用して分析されました。 G12 抗体は 33 mer を検出しますが、他のグリアジン分解フラグメントは検出しません 80。最終量はサンプル重量を考慮して正規化され、結果は平均±SEMとして表されました。統計分析には、社会科学用統計パッケージ (SPSS v22.0; IBM) が使用されました。データは分散の均一性 (Levene 検定) を示し、正規分布 (Shapiro-Wilk 検定) に従っていたため、従来の一元配置分散分析 (ANOVA) を適用しました。

シッティングドロップ蒸気拡散法を使用して、IBMB/IRB共同自動結晶解析プラットフォームで結晶化条件をスクリーニングしました。最適なプロネプロシン結晶（20 mM Tris・HCl pH 7.5、150 mM 塩化ナトリウム中約 20 mg/mL）は、0.1 M 酢酸ナトリウム pH 4.0、22% ポリエチレングリコール (PEG) 6000、10% を使用して 20 °C で得られました。リザーバー溶液としてイソプロパノール。クライオループ (Molecular Dimensions) を使用して結晶を収集し、リザーバー溶液と 15% (v/v) グリセロールからなるクライオバッファーに急速に通過させ、データ収集のために液体窒素中でフラッシュガラス化しました。プロネプロシンのルテチウム誘導体は、天然結晶を 100 mM の Lu-Xo4 結晶団 (ポリバラン)40 を補充した低温緩衝液に 5 分間浸漬し、逆浸漬せずにフラッシュガラス化することによって得られました。 X 線回折データは、ダイヤモンド光源 (ハーウェル、英国) のビームライン I04-1 にある Pilatus 6M-F ピクセル検出器で 100 K で天然結晶から収集されました。ルテチウム派生データは、Generic Data Acquisition (GDA) ソフトウェアで操作される ALBA シンクロトロン (Cerdanyola、カタルーニャ、スペイン) のビームライン XALOC にある Pilatus 6M 検出器に記録されました。

成熟ネプロシン-生成物複合体 (結晶形 I) は、10% PEG 1000、10% PEG 8000 を使用し、20 mM Tris・HCl pH 7.5、250 mM 塩化ナトリウム中、4 °C で約 16 mg/mL のタンパク質濃度で得られました。リザーバー溶液として。液体窒素中でのフラッシュガラス化の前に、同じリザーバー溶液に 15% (v/v) グリセロールを加えた結晶を凍結保護しました。 100 K での X 線回折データは、Pilatus 6M 検出器を使用して ESRF シンクロトロン (グルノーブル、フランス) のビームライン ID30B で収集されました。結晶形 II の成熟ネプロシン-生成物複合体は、同じタンパク質濃度で得られましたが、0.1 M グリシン pH 3.0、150 mM 塩化ナトリウム、20 °C 中で、0.1 M 三塩基性クエン酸ナトリウム pH 5.6、0.5 M 硫酸アンモニウム、1 M リチウムを使用して得られました。リザーバー溶液として硫酸塩。結晶は、20% (v/v) グリセロールを含む溶液で凍結保護されました。回折データは、Pilatus 6M 検出器のビームライン XALOC で収集されました。

回折データは Xds81 および Xscale を使用して処理され、Phenix82 および Ccp483 プログラムスイート用の Xdsconv を使用して MTZ 形式に変換されました。すべての結晶には結晶非対称単位にモノマーが含まれており、補足表 1 はデータ収集と処理に関する重要な統計を示しています。

プロネプロシンの構造は、Phenix パッケージの Autosol プロトコルを適用して、LIII 吸収ピーク波長 (1.34 Å) でルテチウム誘導体結晶から収集したデータを使用した単一波長異常回折によって解析されました。結果として得られたフーリエマップは、wARP/ARP84 を使用してさらに密度変更を受けました。 Lu-Xo4 の開始モデルは、Chimera85 を使用して、Tb3+ との複合体 (Protein Data Bank [PDB] ID 6FRO、残基名 7MT) に見られる化合物の金属キレート部分の座標に適用されるエネルギー最小化によって得られました。 PDB 形式で得られた座標は、モデル構築のために Lu3+ イオンと結合されました。その後、Coot86 での数回の手動モデル構築と、Phenix の Refine プロトコルおよび BUSTER87 プログラムを使用した結晶学的精密化が交互に行われました。最終モデルは、S76 ～ Y85 および N122 ～ N131 を除くプロネプロシン残基 A29 ～ Q380 と、精製タグからの 3 つの追加の C 末端残基 (A401 ～ I402 ～ A403) で構成されました。 2つのLu-Xo4部分が約半分を占めている。合計 5 つの糖残基がそれぞれ N145 と N152 に結合した 2 つの N-結合型グリカン鎖。 2つの酢酸分子。 180 個の溶媒分子。

天然プロネプロシンの構造は、Ccp4 内の Phaser 結晶解析ソフトウェアとルテチウム誘導体結晶構造のタンパク質座標を使用した分子置換によって解明されました。その後のモデルの構築と改良は上記のように進められました。最終モデルには、Y77 ～ Y85 および N122 ～ N131 を除く残基 A29 ～ Q380 に加え、精製タグからの 2 つの追加の C 末端残基 (A401 ～ I402)、合計 4 つの糖残基となる 2 つの N 結合グリカン鎖、および 8 つのアセテートが含まれていました。 1 つのイソプロパノール、4 つのグリセロール、および 257 の溶媒分子。

結晶形 I の天然成熟ネプロシンの生成物複合体の構造も、天然プロネプロシンのフラグメント T132-I402 の座標を使用した分子置換によって解明されました。その後のモデルの構築と改良は上記のように進められました。最終モデルは、残基 T132 ～ Q380 に加え、C 末端タグ全体 (A401 ～ I402 ～ A403+H404 ～ H409)、合計 7 つの糖残基を含む 2 つの N 結合型グリカン鎖、さらに 1 つのトリエチレングリコールおよび 171 の溶媒分子に及びました。結晶形 II の天然の成熟ネプロシンの生成物複合体の構造も、結晶形 I 複合体のフラグメント T132-Q380 を使用した分子置換によって解明されました。最終モデルには、残基 T132 ～ Q380 と H409 を除く C 末端タグ (A401 ～ I402 ～ A403+H404 ～ H408)、および合計 4 つの糖残基と 1 つのニッケルカチオン、3 つの硫酸アニオン、テトラグリシン 1 つとグリシン 1 つ、および 250 個の溶媒分子。おそらく精製に使用した Ni-NTA 樹脂に由来するニッケルイオンは、2 つのヒスチジン残基 (約 1.8 Å) への短いリガンド結合距離に基づいて暫定的に割り当てられました。これは、四面体配位ニッケルイオンについて報告されているもの (平均 1.88 Å) に近かったです。）リザーバー溶液からのより豊富なリチウム（2.03 Å）の場合よりも。テトラグリシンは、特定の条件下でオリゴマー化するこのアミノ酸の能力に基づいて、適切な密度領域に暫定的に配置されました89。補足表 1 は、https://validate-rcsb-1.wwpdb.org/validservice の wwPDB 検証サービスを使用して検証され、www.pdb.org の PDB に寄託された、最終的に洗練されたモデルに関する重要な統計を示しています (アクセスコード) 7ZU8、7ZVA、7ZVB、7ZVC）。

構造の重ね合わせと構造に基づく配列アラインメントは、Coot 内の SSM プログラムを使用して計算されました。フィギュアはキメラを使用して作成されました。構造ベースの類似性検索は Dali90 を使用して実行されました。タンパク質界面は、www.ebi.ac.uk/pdbe/pisa の PDBePISA を使用して計算されました。複合体の相互作用表面は、いずれかの分子の埋没表面積の合計の半分として定義されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

すべてのデータと試薬は、合理的な要求と、学術団体による非営利使用のための秘密保持契約および資料譲渡契約の署名があれば、著者から自由に入手できます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。原子座標は、コード 7ZU8、7ZVA、7ZVB、および 7ZVC で Protein Data Bank から入手できます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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精製と結晶化の際の支援については、IBMB/IRB 共同自動結晶構造解析プラットフォームおよびタンパク質精製サービスの Laura Company、Roman Bonet、Xandra Kreplin、Joan Pous に感謝します。プラスミド pCMV は、デンマーク、オーフス大学の Jan J. Enghild のご厚意により提供されました。著者らはまた、ビームタイムを提供してくれた ESRF、DIAMOND、および ALBA シンクロトロンと、回折データ収集中に支援してくれた各ビームラインスタッフに感謝したいと思います。この研究は、スペインとカタルーニャの公的および民間団体からの助成金によって部分的に支援されました（助成金/フェローシップ参照 PID2019-107725RG-I00 to FXG-R.、ARB、UE and TG; BES-2016-076877 to SRM、BES-2015-） 074583 から LAM、Beatriu de Pinós 2018BP00163 から UE、2017SGR3 および Fundació La Marató de TV3 201815 から FXG-R.、UE、ARB、TG）。著者らは、原稿を編集してくれた Richard M. Twyman に感謝します。

Laura del Amo-Maestro、Soraia R. Mendes などの著者も同様に貢献しました。

タンパク質分解研究室; バルセロナ分子生物学研究所 (CSIC)、バルセロナサイエンスパーク、構造生物学部門。 c/Baldiri Reixac、15-21、08028、バルセロナ、カタルーニャ、スペイン

ラウラ・デル・アモ=マエストロ、ソライア・R・メンデス、アルトゥーロ・ロドリゲス=バンクエリ、ラウラ・ガルソン=フローレス、ティビサイ・ゲバラ、ウルリッヒ・エックハルト、F.ザビエル・ゴミス=ルース

生理学セクション。生化学および生理学部門。バルセロナ大学薬食品科学部、Av. ジョアン XXIII、27-31、08028、バルセロナ、カタルーニャ、スペイン

マリーナジルバル、マリアホセロドリゲスラグナス、アンヘルスフランシュ、フランシスコ J. ペレスカノ

栄養・食品安全研究所 (INSA-UB)、バルセロナ大学、Av. Prat de la Riba、171、08921、サンタコロマデグラメネット、カタルーニャ、スペイン

マリーナジルバル、マリアホセロドリゲスラグナス、アンヘルスフランシュ、フランシスコ J. ペレスカノ

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FXGR がプロジェクトを考案し、監督しました。 LdAM、TG、LG-F。 SRMはタンパク質を生成および精製し、変異体を生成し、インビトロ研究を実施しました。 LdAM、ARB、TG 結晶化タンパク質。 ARB と UE は回折データを収集しました。 UE は実験を実施し、データを分析し、作業員を監督しました。 FXGR は結晶構造を解明し、洗練しました。 FJPC、MG、MJRL、および À.F. らは動物実験を実施し、FXGR は著者全員の協力を得て原稿を執筆しました。

F. ザビエル・ゴミス・ルースへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Hans Brandstetter と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

デル・アモ・マエストロ、L.、メンデス、SR、ロドリゲス・バンクエリ、A. 他セリアック病治療のためのグルタミン酸クラスプロリルエンドペプチダーゼの分子研究および生体内研究。 Nat Commun 13、4446 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-32215-1

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受信日: 2022 年 5 月 16 日

受理日: 2022 年 7 月 21 日

公開日: 2022 年 8 月 1 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32215-1

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