新規Nの同定と生化学的特性評価 | ShijiasunAgilePeak Ventures Co.,Ltd

Scientific Reports volume 12、記事番号: 16991 (2022) この記事を引用

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N-アセチルグルコサミン (GlcNAc) は、糖タンパク質や細胞壁などのグリカンの重要な成分です。 GlcNAc キナーゼは、GlcNAc にリン酸を転移して、グリカン合成の前駆体となる GlcNAc-6-リン酸を生成する酵素です。 GlcNAc キナーゼは、病原性酵母、ヒト、細菌などの広範囲の生物で見つかっています。しかし、この酵素は真核生物モデルである出芽酵母ではこれまで発見されていませんでした。この研究では、S. cerevisiae 由来の最初の GlcNAc キナーゼが同定され、Ngk1 と命名されました。 GlcNAcおよびグルコースに対するNgk1のKm値はそれぞれ0.11mMおよび71mMであり、ヘキソキナーゼとは異なり、Ngk1がGlcNAcに対して高い親和性を有することが示唆された。 Ngk1は、ATP、CTP、GTP、ITP、UTPといった様々なヌクレオシド三リン酸をリン酸供与体としてGlcNAcリン酸化活性を示した。 Ngk1 は、他の酵素とのアミノ酸配列の同一性がわずか約 20% 以下であるため、既知の酵素とは系統発生的に離れています。 S. cerevisiae における Ngk1 の生理学的役割についても説明します。

N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）は、原核生物と真核生物の両方に遍在する炭水化物であり、N-糖タンパク質、GPIアンカー、細菌のペプチドグリカンや酵母のキチンなどの細胞壁などのグリカンの必須成分です1、2、3。ウリジン二リン酸 N-アセチルグルコサミン (UDP-GlcNAc) は、グリカン生合成において、原核生物と真核生物の両方において必須の基質です。これは、このヌクレオチド糖の GlcNAc 部分がグリコシルトランスフェラーゼによってグリカンに組み込まれるためです 2,3。一般に、UDP-GlcNAc は解糖中間体であるフルクトース-6-リン酸 (Fru-6-P) から合成され、グルコサミン-6-P3 に変換されます。真核生物では、グルコサミン-6-P がアセチル化されて GlcNAc-6-P になり、その後異性化されて GlcNAc-1-P3 になります。一方、原核生物では、グルコサミン-6-P は主にグルコサミン-1-P に異性化され、その後アセチル化されて GlcNAc-1-P3,4 になります。最終ステップでは、原核生物と真核生物の両方で、GlcNAc-1-P がウリジル化によって UDP-GlcNAc に変換されます 3,4。

GlcNAc キナーゼ (EC 2.7.1.59) は、細菌、病原性酵母、植物、動物を含む幅広い生物種で発見された GlcNAc 代謝酵素です 3、4、5、6、7、8。この酵素は、ATP のガンマホスホリル基を GlcNAc の C-6 のヒドロキシル基に転移させて、GlcNAc-6-P を生成します。 GlcNAc キナーゼは、ヘキソキナーゼ (EC 2.7.1.1) と構造的に関連しています。ヘキソキナーゼは、グルコース (Glc) に優先的に作用して解糖の最初のステップで Glc-6-P を生成する別のタイプの糖キナーゼです。これらの酵素は一般に ATPase を持っているためです。ドメイン9、10。哺乳類では、GlcNAcキナーゼはUDP-GlcNAc11の前駆体となり得るGlcNAc-6-Pを生成するため、UDP-GlcNAc生合成のサルベージ経路を提供する酵素として知られている。対照的に、Fru-6-P 生合成のための GlcNAc 利用における大腸菌の GlcNAc キナーゼである NagK の役割は、GlcNAc-6-P を Fru-6-P に変換する逆経路が存在するため研究されてきました。解糖系のエネルギー源4．同様に、病原性酵母カンジダアルビカンスの GlcNAc キナーゼである CaNag5 も同定され、エネルギー源として Fru-6-P を生成するための GlcNAc 利用に関与していることが報告されました 3,5,6。細菌と同様に、C. albicans は GlcNAc を炭素源として増殖できます。実際、C. albicans には GlcNAc を Fru-6-P に変換する経路が存在します。これは、GlcNAc キナーゼ (CaNAG5) および GlcNAc-6-P デアセチラーゼ (CaNAG2) と GlcNAc-6-P デアセチラーゼ (CaNAG2) からなる GlcNAc 代謝酵素の遺伝子クラスターが存在するためです。グルコサミン-6-P デアミナーゼ (CaNAG1) は、大腸菌のこれらの酵素との配列類似性から同定されました4。これらの遺伝子の破壊により、炭素源として GlcNAc を用いた C. albicans の増殖が遅れることが示されました。

C. albicans とは異なり、出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae は炭素源として GlcNAc で増殖しません 3,5,6。さらに、CaNAG5、CaNAG2、または CaNAG1 のいずれかと類似した遺伝子は、S. cerevisiae の全ゲノムには保存されていません6。したがって、S. cerevisiaeはこれらのGlcNAc代謝酵素を保有していないと考えられてきた。 S. cerevisiae では、3 つのヘキソキナーゼ、Hxk1、Hxk2、および Glk1 の存在が 1980 年代から知られています 12。 S. cerevisiae は Hxk1、Hxk2、Glk1 以外のヘキソキナーゼを持たないと数十年にわたり考えられてきました。しかし、我々は、他の 2 つのヘキソキナーゼ様遺伝子 (しかしその機能は不明)、EMI2 と YLR446W の存在に気づき、注目しました。我々の以前の研究では、Emi2タンパク質は、これまで知られていたHxk1、Hxk2、Glk113に加えて、S. cerevisiaeの4番目の新しいヘキソキナーゼとして同定されました。本研究では、標準遺伝子名が存在しないもう一つのヘキソキナーゼ様遺伝子 YLR446W (系統名) に焦点を当て、それがこのモデル生物における新たなヘキソキナーゼであるかどうかを調べた。予期せぬことに、我々は、YLR446Wが、他の生物由来の既知のGlcNAcキナーゼと低い配列類似性を示す新規GlcNAcキナーゼをコードしていることを発見した。

YLR446W 遺伝子は、433 アミノ酸からなるタンパク質をコードし、ヘキソキナーゼ様の ATPase ドメインを持つ機能不明の遺伝子です。相同性検索の結果、YLR446W遺伝子がコードするタンパク質（YLR446Wp）と高い類似性を有する機能既知の酵素は見つからなかった。ただし、YLR446Wpは、S. cerevisiaeのHxk1、Hxk2、Glk1、およびEmi2と約20％の配列同一性を持っています（補足図S1）。さらに、この遺伝子産物は、Hxk1、Hxk2、Glk1、および Emi29,13 の場合と同様、シグナルペプチド配列を持たない約 50 kDa のサイトゾルタンパク質であると予測されました。そこで、この遺伝子がヘキソキナーゼをコードしているかどうかを調べ始めました。組換え YLR446Wp は大腸菌細胞で発現され、酵素アッセイで使用するために精製されました (データは示されていません)。

通常、ATP は、Mg2+ などの二価陽イオンと複合体を形成することにより、ヘキソキナーゼのホスホリル供与体となります。 YLR446Wpは、ATPおよびMg2+の存在下で低いグルコースリン酸化活性（0.010 U/mg）を示すことがわかりました（図1a）。 ATPとMg2+、Co2+、またはMn2+のいずれかの存在下でのグルコースリン酸化の相対活性レベルは、それぞれ100％、170％、80％であり（図1b）、Mg2+がCo2+またはMn2+で置換できることが示唆されました。一方、Ca2+やZn2+の存在下では酵素活性はほとんど検出されなかった。二価陽イオンが存在しない場合、ATP の存在下では酵素活性は観察されませんでした (図 1a および b)。これらの結果は、YLR446Wp が既知のヘキソキナーゼの場合と同様に、二価カチオンを必要とする Glc に作用するキナーゼであることを示しました 13。また、10 mM Glc の存在下でのこの酵素のグルコキナーゼ活性は、他の 4 つのヘキソキナーゼの活性よりも低いこともわかりました。その値は、我々のアッセイ条件下で Hxk1、Hxk2、Glk1、および Emi2 について 0.044 ～ 180 mU でした。 YLR446Wp の最も高い活性は Co2+ の存在下で観察されましたが、細胞内の Co2+ は微量のみ検出されました 14。一方、Mg2+ は酵母細胞に豊富に含まれており、ATP 依存性キナーゼの主要な補因子として知られています 15。したがって、次の実験では Mg2+ の存在下で酵素アッセイを実行することにしました。

YLR446WpのGlcリン酸化活性のアッセイ。 (a) グルコースリン酸化に対する YLR446Wp の酵素活性は、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ共役アッセイを使用してモニタリングされました。 Ngk1 によるグルコースリン酸化の反応を、MgCl2 の存在下 (+) または非存在下 (-) で評価しました。 (b) MgCl2、CoCl2、MnCl2、ZnCl2、CaCl2、または EDTA のいずれかの存在下でのグルコースリン酸化の比活性を比較しました。 MgCl2 存在下での比活性のパーセンテージを 100% として設定しました。エラーバー、2 つの独立した実験の標準偏差。

Hxk1、Hxk2、Emi2 などの既知のヘキソキナーゼのほとんどは、グルコースだけでなくマンノース、フルクトース、グルコサミンにも作用します 13,16。 YLR446Wpがグルコース以外の単糖をリン酸化できるかどうかを、反応生成物をTLCでモニタリングすることにより検討した。フルクトース、マンノース、ガラクトースのいずれを糖基質として用いた場合でもリン酸化生成物はほとんど検出されず、この酵素はこれらの単糖を基質として認識しないことが示唆された。対照的に、この酵素は、30分間の反応後に糖基質の減少とともにリン酸化生成物が生成されたため、GlcNAcに対するリン酸化活性を示します（図2a）。他のアミノ糖、グルコサミン、N'N'-ジアセチルキトビオース、UDP-GlcNAc、N-アセチルマンノサミンおよびN-アセチルガラクトサミンのリン酸化も調べたところ、この酵素はGlcNAc以外のこれらのアミノ糖に対して検出可能な活性を示さないことがわかりました（図） .2b)。対照的に、他の酵母ヘキソキナーゼ、Hxk1、Hxk2、Glk1、およびEmi2はいずれも、GlcNAcに対して検出可能な活性を示さなかった（補足図S2）。一方、これらのヘキソキナーゼはすべて Glc に対して明らかに活性を示しました。

YLR446Wpの糖基質特異性のTLC分析。単糖類 (a) およびアミノ糖 (b) に対する酵素の基質特異性を TLC でモニタリングしました。 ATP、MgCl2、および以下の各糖を含む反応: GlcNAc、Glc、フルクトース (Fru)、マンノース (Man)、ガラクトース (Gal)、グルコサミン (GlcN)、N'N'-ジアセチルキトビオース (GlcNAc2)、UDP- GlcNAc、N-アセチルマンノサミン (ManNAc)、または N-アセチルガラクトサミン (GalNAc) を、酵素あり (+) または酵素なし (-) で 30 分間実行しました。 Glc-6-P または GlcNAc-6-P (それぞれ 15 nmol) を標準化合物として TLC プレートに適用しました。 S、糖基質。 P、製品。

YLR446WpがGlcNAcキナーゼ活性を有することを確認するために、反応生成物をHPLCで分析した。酵素との3時間の反応後、GlcNAcのピーク(S: RT = 4.19分)は減少し、生成物(P: RT = 10.39分)に大部分が置き換えられました(図3aおよびb)。反応生成物 (P) の保持時間は、GlcNAc-6-P の保持時間と本質的に一致しました。別のGlcNAcリン酸であるGlcNAc-1-Pは、同じ条件下で9.87分に溶出されたことに留意されたい(データは示さず)。さらに、ESI-MS 分光法により、反応生成物の分子量 (P: RT = 10.39 分) が GlcNAc-6-P の計算質量 [m/z [M − H]− 300] と一致することが示されました。これらの結果は、S. cerevisiae の他の既知のヘキソキナーゼとは異なり、YLR446Wp が GlcNAc-6-P を生成する GlcNAc キナーゼ活性を保有していることを示唆しています。

GlcNAc リン酸化生成物の HPLC 分析。 10 mM GlcNAc、10 mM ATP、および 10 mM MgCl2 を含む酵素の非存在下 (a) または存在下 (b) の反応混合物を、50 mM Tris-HCl (pH 8.0) 中で 30 °C で 1 分間実施しました。３時間放置し、ＨＰＬＣで分析した。 UV = 205 nm で検出された各ピークの保持時間は、標準化合物の保持時間と一致しました: S、GlcNAc (4.2 分)。 P、GlcNAc-6-P (10.4 分); ADP (12.4 分); *、トリス (4.7 分)。

GlcNAc と Glc の速度論的パラメーターは、ピルビン酸キナーゼと乳酸デヒドロゲナーゼを組み合わせたアッセイを使用して、ATP 依存性の糖リン酸化による ADP の生成をモニタリングすることによって比較されました。アッセイの前に、Tris-HCl 緩衝液を使用して pH 8.0 付近で最大の酵素活性が得られることを確認しました。 GlcNAcおよびGlcのKm値はそれぞれ0.11 mMおよび71 mMと決定され、GlcNAcに対するこのキナーゼの親和性がGlcの親和性よりも約500倍高いことが示されました（図4aおよびb）。ただし、これらの糖の代謝回転速度には大きな違いはなく、GlcNAc と Glc の kcat 値はそれぞれ 2.3 s-1 と 1.1 s-1 でした。糖基質としてGlcNAcを使用した場合のATPに対するNgk1のKmおよびkcat値は、それぞれ1.2mMおよび3.4s-1と決定された(データは示さず)。 S. cerevisiae の他の 4 つのヘキソキナーゼのグルコースリン酸化に対する Km 値は 0.20 mM 未満 (0.011 ～ 0.20 mM) であると報告されていますが、これらの酵素の kcat 値は広い範囲 (0.042 ～ 63 s-1) を超えていました 13。、16．これらの結果から、我々は、YLR446Wは典型的なヘキソキナーゼをコードしておらず、GlcNAcに特異的であり、S. cerevisiaeではこれまで同定されていない新規なシュガーキナーゼをコードしていると結論付けた。したがって、この遺伝子を N-アセチルグルコサミンキナーゼ 1 にちなんで NGK1 と名付けました。

YLR446W は、Ngk1 という名前の GlcNAc キナーゼをコードします。 GlcNAc (a) および Glc (b) の Ngk1 キナーゼ活性の速度論的分析は、ピルビン酸キナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ共役アッセイを使用して実行されました。

ATP 以外のヌクレオシド三リン酸に対する GlcNAc キナーゼの反応性についてはほとんど知られていません。酵母細胞には非 ATP ヌクレオシド三リン酸、CTP、GTP、ITP、UTP17 が含まれていることが報告されています。したがって、我々は、これらのヌクレオシド三リン酸のそれぞれをリン酸供与体として用いて、Ngk1活性を調べた。 Ngk1との反応後、ATP、GTP、CTP、ITP、UTPなどのヌクレオシド三リン酸を使用してリン酸化生成物を観察しました（図5a）。 GTP、CTP、ITP、UTP に対する相対活性は、ATP と比較して、それぞれ 15%、10%、41%、25% でした (図 5b)。 HPLCにおける各生成物の保持時間は、GlcNAc-6-Pの保持時間と一致していた(データは示さず)。これらのデータは、Ngk1 が広範な種類のヌクレオシド三リン酸を利用して GlcNAc-6-P を生成できることを示唆しています。

さまざまなヌクレオシド三リン酸に対する Ngk1 の反応性の分析。リン酸化供与体としてATP、GTP、CTP、ITP、またはUTPのいずれかを使用したGlcNAcリン酸化のNgk1活性を測定した。 (a) 酵素あり (+) または酵素なし (-) の反応 (40 分) の TLC 分析。 S、糖基質。 P、製品。（b）比活性は、異なるヌクレオシド三リン酸との反応（20分間）後、HPLCを使用してGlcNAc-6-P濃度を測定することによって決定されました。 ATPに対するNgk1の比活性を100%として設定した。エラーバー、2 つの独立した実験の標準偏差。

配列同一性が低い(15%未満)ため、Ngk1配列を既知の一次構造のGlcNAcキナーゼ(例えば、ヒトおよび細菌のGlcNAcキナーゼ)と整列させることは困難であった。 GlcNAcキナーゼは機能的および構造的にヘキソキナーゼと類似していると推定されるため、S. cerevisiaeの既知のヘキソキナーゼとのアラインメントにより、反応に関与する可能性のあるアミノ酸残基を検索しました（補足図S1）。それらの中で、Hxk2 の構造と機能の関係はよく研究されています 18。多重アラインメントにより、Ngk1 の Asp-196 および Lys-152 がそれぞれ推定上の触媒残基および ATP 結合残基である可能性があることが示されました。 Asp-196またはLys-152のいずれかをAla（D196AまたはK152A）に置き換えると、酵素活性が大幅に減少しました（補足図S3）。 D196E は依然として酵素活性の一部を占めていましたが、D196A および D196N は一晩反応した後でも検出可能な活性を示さなかったのです。これらの結果は、酵素触媒作用に重要な残基が Ngk1 に保存されている可能性があるが、Ngk1 と S. cerevisiae の他のヘキソキナーゼとの全体的な同一性は約 20% にすぎないことを示唆しています。

系統解析により、Ngk1 が他の既知の GlcNAc キナーゼおよびヘキソキナーゼから離れていることが示されました (図 6)。既知の酵素の中で、C. albicans 由来の GlcNAc キナーゼ (Ca.NAG5) が Ngk1 に最も近かったが、それらの間のアミノ酸配列の同一性は 22% にすぎません。高等真核生物 (それぞれヒトおよびシロイヌナズナ由来の Hs.NAGK および At.GNK) と細菌 4 (大腸菌由来の Ec.NagK) の両方に由来する他の既知の GlcNAc キナーゼは、Ngk1 と配列が同一であるため、S. cerevisiae Ngk1 とは明らかにかけ離れていました。は15％未満でした。 Ngk1に類似した遺伝子は、Zygosaccharomyces rouxii（Zr.仮説タンパク質、Ngk1と41％同一）などのサッカロマイセ科の酵母において仮説タンパク質として保存されているが、そのどれも特徴付けられていないことに留意されたい。

GlcNAcキナーゼおよびヘキソキナーゼを使用したNgk1の系統解析。同定または推定される GlcNAc キナーゼおよびヘキソキナーゼの系統樹。以下の系統樹は、Clustal Omega19 を使用して生成され、Dendroscope 320 で視覚化されました。 S. cerevisiae の Ngk1 およびヘキソキナーゼ: Sc.Unch(Ngk1)(AAT92658.1)、Sc.Hxk1(NP_116711.3)、Sc.Hxk2(NP_011261)。 1). )、Sc.Glk1 (NP_009890.1)、Sc.Emi2 (NP_010804.3)。 C. albicans (Ca.NAG5、BAB43816.1)、ヒト (Hs.NAGK、EAW99780.1)、E. coli (Ec.NagK、NP_415637)、Salmonella enterica (Se.NagK、EDN6582917.1) の GlcNAc キナーゼ、シロイヌナズナ (At.GNK、NP_564358.1)、ユートレマサルギネウム (Es.NAGK、XP_006415457.1)、ゴリラゴリラ (Gg.NAGK、XP_018876635.1)。黄色ブドウ球菌 (Sa.ROK、WP_000291445.1) および黄色ブドウ球菌 (Sp.ROK、WP_214533982.1) の N-アセチルマンノサミンキナーゼ。高等真核生物、ヒト (Hs.HKDC1、NP_079406.4)、シロイヌナズナ (At.Hexokinase1、NP_194642.1)、およびダニオレリオ (Dr.Hexokinase-2、NP_998231.1) のヘキソキナーゼ。 Candida Tropicis の仮説タンパク質 (Ct.仮説タンパク質、XP_002549429.1) および Zygosaccharomyces rouxii (Zr.仮説タンパク質、GAV52624.1)。

この研究では、真核生物モデル生物である S. cerevisiae から最初の GlcNAc キナーゼを同定しました。これまでに、GlcNAc キナーゼは細菌や動物を含む幅広い生物から同定されています。しかし、全ゲノム中に既知の GlcNAc キナーゼに類似した遺伝子が存在しないため、S. cerevisiae には GlcNAc キナーゼが存在しないと考えられてきました。実際、S. cerevisiae の機能不明・無名遺伝子 YLR446W は、既知の GlcNAc キナーゼとの配列類似性が約 20% 以下であるため、アミノ酸配列からは GlcNAc キナーゼの遺伝子であると予測できませんでした。今回、YLR446Wpの生化学的性質を決定し、この遺伝子がGlcNAcキナーゼをコードしていることを発見し、それをNgk1と名付けました。

我々の酵素分析は、Ngk1がGlcNAcとGlcの両方に対してキナーゼ活性を持っていることを示しましたが、GlcNAcとGlcのKm値はそれぞれ0.11 mMと71 mMでした（図4a、b）。 S. cerevisiae 細胞の細胞内グルコース濃度が約 1.5 mM21 であると推定されていることを考慮すると、Ngk1 は生理学的条件下ではグルコースリン酸化に関与していない可能性があります。他の生物の GlcNAc キナーゼの生化学分析に関する報告がいくつかあります。 C. albicans およびヒト由来の GlcNAc キナーゼの Km 値は、それぞれ 0.38 mM および 0.45 mM であると報告されています 6,8。したがって、Ngk1 の GlcNAc に対する親和性は、他の GlcNAc キナーゼに対する親和性よりも高くなります。 Ngk1は、GlcNAcとGlcを除いて、どの糖に対してもキナーゼ活性を示さなかった（図2a、b）。ヒト GlcNAc キナーゼは、GlcNAc8 よりも程度は低いものの、ManNAc および Glc に作用します。一方、C. albicans Nag5 は、Glc およびマンノースに対して部分的な活性を持ちますが、ManNAc6 に対しては活性を持ちません。 Ngk1は、GTP、CTP、ITP、UTPなどの任意の糖ヌクレオチドに対して活性を示し（図5a）、Ngk1が広範囲のヌクレオシド三リン酸をリン酸供与体として利用している可能性があることを示唆しています。糖キナーゼの各種ヌクレオシド三リン酸に対する反応性に関する報告は少ないが、CaNag5 は ATP と CTP5 を除いてこれらの糖ヌクレオチドに対してキナーゼ活性を示さないことが報告されている。総合すると、これらの結果は、GlcNAc キナーゼの酵素特性がその種の酵素特性とは異なることを示唆しています。異なる種に由来する GlcNAc キナーゼは系統発生的に離れていますが、異なる種に由来するヘキソキナーゼは比較的近いです (図 6)。したがって、異なる種の GlcNAc キナーゼは遠い起源に由来し、独自に進化した可能性があります。注目すべきことに、Ngk1に類似した遺伝子は、仮説上のまたは機能的に未知のタンパク質として、Z. rouxiiなどの真菌のさまざまな属にわたって保存されています。 S. cerevisiae の Ngk1 は、GlcNAc キナーゼの新しいクラスターの発見への手掛かりとなる可能性があります。

GlcNAc キナーゼの生理学的重要性は不明瞭ですが、この酵素は細菌からヒトまでの幅広い生物で発見されています。 C. albicans では、Nag5 の破壊により、マウスにおけるその毒性が弱まり、GlcNAc 培地での増殖が低下することが報告されました 6。哺乳類の GlcNAc キナーゼは、リソソームに由来すると考えられる細胞内 GlcNAc をリン酸化することにより UDP-GlcNAc 合成のサルベージ経路を提供すると考えられていますが 11、実験的証拠はほとんど報告されていません。大腸菌では、細胞外 GlcNAc は細胞への輸送中にリン酸化されるため、NagK は細胞壁ムレイン分解に由来する細胞内 GlcNAc の利用に役割を果たすことが知られています 4。少なくとも、S. cerevisiae の Ngk1 は、解糖のための GlcNAc 代謝には寄与していない可能性があります。これは、この微生物が炭素源として細胞外 GlcNAc を利用して増殖しないためです5。 1 つの可能性は、Ngk1 が細胞内で GlcNAc をリン酸化することによって UDP-GlcNAc 生合成に寄与している可能性があることです。しかし、この生物では細胞内にGlcNAcを供給する経路が同定されていないため、細胞内に遊離したGlcNAcが細胞の外側または内側から存在し得るかどうかはまだ不明である。 UDP-GlcNAcは既知の経路を介してFru-6-Pから合成されるため、おそらく、十分なグルコースの存在下で栄養増殖する細胞にはNgk1が不要である可能性がある。実際、Ngk1 を欠く酵母細胞は、十分なグルコースの存在下で正常に増殖しました (データは示されていません)。ゲノムワイドのトランスクリプトームにより、この遺伝子の転写物が胞子形成および折り畳まれていないタンパク質の応答中に上方制御されることが示唆されたことを考えると 22,23、Ngk1 は、特定の条件下で代替供給経路 GlcNAc-6-P として UDP の前駆体として役割を果たしている可能性があります。 GlcNAc。 S. cerevisiae における Ngk1 の生理学的役割を解明するための分析が進行中です。

YLR446W の ORF 領域の全長 DNA 断片を、S. cerevisiae BY4742 株 (Invitrogen、Waltham、MA、USA) のゲノム DNA を鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマー (forward: 5'-ATTTATCATATGACAATTGAAAGCACTCTAGCTCGGG -) を用いた PCR によって増幅しました。 3'; 逆: 5'-ATTTATCTCGAGTTATTGAACTTGGTTGTCTGATTTGTTCAAGTAGGTG-3')。増幅したDNA断片をNde IおよびXho Iで消化し、pCold IIベクター（タカラバイオ、滋賀県、日本）の対応する部位にライゲーションし、N末端でHis6タグと融合させた。得られたプラスミド（pColdII-His6-Ngk1）の塩基配列をDNA配列決定により確認した。次に、大腸菌BL21(DE3)をpColdII-His6-Ngk1で形質転換し、メーカーのプロトコールに従って組換えタンパク質を発現させた。細胞を回収し、150 mM NaCl、1 mM フェニルメチルスルホニルフルオリド、および 1 mM ジチオスレイトールを含む 50 mM Tris-HCl 緩衝液 (pH 8.0) 中で氷上で超音波処理しました。無細胞抽出物を HisTrap™ HP カラム (GE Healthcare、シカゴ、イリノイ州、米国) に適用し、メーカーのプロトコールに従ってタンパク質を精製しました。タンパク質濃度は、Protein Assay CBB solution (Nacalai Tesque、京都、日本) を使用して測定しました。 Hxk1、Hxk2、Glk1、および Emi2 の組換えタンパク質は、以前に報告されているように調製されました 13。

Ngk1 の部位特異的突然変異誘発は、QuikChange 部位特異的突然変異誘発キット (Stratagene、ドイツ) に記載されている手順に従って、テンプレートとして pColdII-His6-Ngk1 と補足の表 S1 に記載されているオリゴヌクレオチドプライマーを使用して PCR によって実行されました。各プラスミドの変異は DNA 配列決定によって確認されました。得られたプラスミドを用いて、野生型酵素について上述したように、Ngk1の各変異型酵素を大腸菌BL21(DE3)で発現させ、精製後に酵素アッセイに使用した。

Ngk1 のグルコキナーゼ活性の測定は、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ (オリエンタル酵母、東京、日本) と NAD+ から NADH への変換とのカップリング反応によって実施されました 13,24。アッセイ混合物には、10 mM グルコース、5 mM ATP、5 mM MgCl2、2 mM NAD+、50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、1.6 U/mL グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、および適切な量の酵素が含まれています。二価カチオンの効果を調べるために、5 mM MgCl2 を同じ濃度の CoCl2、MnCl2、ZnCl2、CaCl2、または 1 mM EDTA のいずれかに置き換えました。酵素を添加することによって 30 °C での反応を開始し、続いて NADH 生成について 340 nm での吸光度の増加をモニタリングしました。 1 ユニット (U) は、30 °C で 1 分あたり 1 μmol の Glc のリン酸化を触媒する酵素の量として定義されます。

異なる糖に対する酵素の基質特異性を調べるには、10 mM 糖 (GlcNAc、グルコース、マンノース、フルクトース、ガラクトース、グルコサミン、N-アセチルマンノサミン、UDP-GlcNAc または N'N'-ジアセチルキトビオースのいずれか) を含む反応、10 mM ATP および 10 mM MgCl2 は、酵素の有無にかかわらず、50 mM Tris-HCl (pH 8.0) 中で 30 °C で指定の時間実行されました。ホスホリル供与体として異なるヌクレオシド三リン酸を使用する酵素アッセイでは、糖基質として GlcNAc を使用して、ATP をヌクレオシド三リン酸 (GTP、CTP、ITP、または UTP) のいずれかに置き換えました。１００℃で３分間加熱することにより反応を停止させた。反応生成物をTLCおよびHPLCで分析した。 1 ユニット (U) は、30 °C で 1 分あたり 1 μmol の GlcNAc のリン酸化を触媒する酵素の量として定義されます。

サンプル (3 μL) を TLC シリカゲル 60 F254 プレート (Merck、ダルムシュタット、ドイツ) 上にスポットしました。プレートを 1-ブタノール/酢酸/水 (8/3/2) で現像し、乾燥させ、発色試薬 (2% ジフェニルアミン、2% アニリン、および 85% リン酸) に浸した後、100 °C でベーキングしました。 10分間市販の Glc-6-P、GlcNAc-6-P、および GlcNAc を標準として使用しました。

反応生成物を、ＣＯＳＭＯＳＩＬＨＩＬＩＣカラム（ナカライテスク、日本）および２０５ｎｍのＵＶ検出器を使用するＨＰＬＣによって分析した。リン酸ナトリウム緩衝液 (10 mM、pH 7.0) とアセトニトリル (40:60、v/v) の混合物を流速 1.0 mL/min で移動相として使用し、カラム温度を 30 °C に設定しました。。市販の GlcNAc、GlcNAc-6-P、GlcNAc-1-P、ADP、および Tris を標準として使用しました。 GlcNAc-6-Pは、積分されたピーク面積から定量されました。 ESI-MS も実行し、LCMS-2010EV 質量分析計 (島津製作所、京都、日本) を使用して、反応生成物中の GlcNAc-6-P と推定される分子の質量を決定しました。

速度論的パラメータを決定するために、以前に確立されたように、ピルビン酸キナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ共役アッセイを使用して、糖のリン酸化によって形成されるADPの量を測定した13,24。アッセイ混合物は、糖基質として 6 ～ 7 種類の異なる濃度の GlcNAc (0.031 ～ 2.0 mM) またはグルコース (7.3 ～ 500 mM)、5 mM ATP、5 mM MgCl2、5 mM ホスホエノールピルビン酸、0.3 mM NADH、50 mM Tris で構成されています。 HCl (pH 8.0)、18 U/mL ピルビン酸キナーゼ (Oriental Yeast、日本)、20 U/mL 乳酸デヒドロゲナーゼ (Oriental Yeast、日本)、および適切な量の Ngk1。 Ngk1を添加することによって30℃での反応を開始し、続いて340nmでの吸光度におけるNADHの減少をモニタリングした。 Km 値と kcat 値は、Origin ソフトウェア (OriginLab、米国マサチューセッツ州ノーサンプトン) を使用した非線形回帰分析によって決定されました。

この研究で生成および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

フルクトース

グルコース

N-アセチルグルコサミン

1-リン酸塩

6-リン酸塩

ウリジン二リン酸 N-アセチルグルコサミン

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MS分析については勝崎博隆博士（三重大学）に感謝します。また、技術サポートをしていただいた水田理樹氏にも感謝いたします。この研究は、JSPS 科研費番号 22K05380 および大阪発酵研究所 (助成金番号 G-2022-2-009) の一部による資金援助を受けました。

〒514-8507 津市、三重大学大学院生物資源研究科

Midori Umekawa, Ayano Nishikawa, Naoto Isono & Shuichi Karita

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MU は実験を考案し、原稿を書きました。 NI は原稿を修正しました。 MU、AN、NI が実験を実施しました。 MUとSKは結果を分析した。著者全員が原稿をレビューしました。

梅川みどりさんへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

梅川正人、西川明、磯野直也他出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）における新規N-アセチルグルコサミンキナーゼの同定と生化学的特性評価。 Sci Rep 12、16991 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-21400-3

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受信日: 2022 年 6 月 9 日

受理日: 2022 年 9 月 27 日

公開日: 2022 年 10 月 10 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21400-3

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