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Nature Communications volume 13、記事番号: 4906 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

活性化エステルまたはフェノキシラジカルに基づく酵素ベースの近接標識アプローチは、生細胞内の細胞内プロテオームおよびタンパク質相互作用物質のマッピングに広く使用されています。 しかし、活性化エステルは反応性が低いため、標識半径が広くなり、過酸化物処理によって生成されるフェノキシラジカルが酸化還元感受性経路を妨害する可能性があります。 ここでは、光増感タンパク質 miniSOG を目的のタンパク質に遺伝的に結合することによって設計された光活性化依存性近接標識 (PDPL) 法を報告します。 青色光によってトリガーされ、照射時間によって調整されると、一重項酸素が生成され、その後、ヒスチジン残基の時空間分解アニリンプローブ標識が可能になります。 私たちは、細胞小器官特異的なプロテオームのマッピングを通じてその高忠実度を実証します。 PDPL と TurboID を並べて比較すると、PDPL によるより具体的でより深いプロテオミクスの範囲が明らかになります。 さらにPDPLを疾患関連転写コアクチベーターBRD4およびE3リガーゼParkinに適用し、これまで知られていなかった相互作用因子を発見します。 過剰発現スクリーニングにより、Parkin の 2 つの未報告基質 Ssu72 および SNW1 が同定され、その分解プロセスはユビキチン化プロテオソーム経路によって媒介されます。

タンパク質ネットワークの正確な特徴付けは、多くの基本的な細胞プロセスを支えています1。 したがって、タンパク質相互作用の忠実度の高い時空間マッピングは、生物学的経路や疾患の病態を解読するための分子基盤を提供するだけでなく、治療目的でこれらの相互作用を混乱させる可能性も提供するでしょう2。 この目的を達成するには、生きた細胞や組織における一時的な相互作用を検出できる方法が強く必要とされています。 アフィニティー精製質量分析法 (AP-MS) は、歴史的に、目的のタンパク質 (POI) の結合パートナーをプルダウンするために使用されてきました。 定量的プロテオミクスアプローチの進歩により、AP-MS に基づく最大のタンパク質ネットワークデータベース Bioplex3.0 が確立されました 3。 AP-MS は非常に強力ですが、ワークフローにおける細胞溶解および希釈ステップは、弱い一時的な結合相互作用に偏り、溶解前の区画化を欠いた偽の相互作用ペアなどの溶解後のアーチファクトを引き起こします4。

これらの課題に取り組む試みとして、架橋基を備えた非天然アミノ酸 (UAA) および酵素的近接標識 (PL) プラットフォーム (APEX や BioID など) が開発されました5。 UAA 法は多くのシナリオに適用され、直接タンパク質結合体に関する情報を提供しています 6 が、依然として UAA 挿入部位の最適化が必要です。 さらに重要なことは、これは標識イベントの触媒代謝回転を欠く化学量論的標識方法であるということです。 逆に、BioID 法などの酵素的 PL 法は、人工ビオチンリガーゼを POI7 に融合させ、その後ビオチンを活性化して反応性エステルビオチノイル-AMP 中間体を生成します。 そのため、酵素は触媒作用を及ぼし、近位のリジン残基にタグを付ける活性化ビオチンの「雲」を放出します。 ただし、BioID は十分な標識シグナルを取得するのに 12 時間以上かかるため、時間的に解決された方法での適用が妨げられます。 酵母ディスプレイベースの指向性進化を使用して、TurboID ははるかに効率的に BioID から設計され、10 分以内に効果的なビオチン標識を達成し、より動的なプロセスの研究を可能にしました。 TurboID は活性が高く、低レベルの標識には内因性のビオチンレベルで十分であるため、外因性ビオチンの添加により強力に強化され、時間制御された標識が必要な場合、バックグラウンド標識が潜在的な懸念事項になります。 さらに、活性化エステル種は反応性が低いため (t1/2 ～ 5 分)、特に隣接するタンパク質がビオチン 5 で飽和した後では、標識範囲が広くなる可能性があります。 別のアプローチでは、人工アスコルビン酸ペルオキシダーゼ (APEX) の遺伝子融合により、H2O2 による活性化によりビオチン-フェノールラジカルが生成され、1 分以内にタンパク質標識が達成されます 9,10。 APEX は、細胞内プロテオーム、膜タンパク質複合体、細胞質シグナル伝達タンパク質複合体の同定に広く使用されています 11、12。 ただし、高濃度の過酸化物が必要な場合は、酸化還元感受性タンパク質や経路に影響を与え、細胞プロセスを混乱させる可能性があります。

したがって、高い空間的および時間的忠実度で、細胞経路に大きな混乱をもたらすことなく、より反応性の高い種を生成して標識半径を制限できる新しい方法は、現在の方法を補完する重要なものとなるでしょう。 反応性種の中でも、一重項酸素は、その寿命が短く、拡散半径が限られている（細胞内で t1/2 < 0.6 μs）ため、私たちの注目を集めました 13。 一重項酸素は、アミンまたはチオールベースのプローブと連結されているメチオニン、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを無差別に酸化して極性を弱めることが報告されています 14,15。 一重項酸素は細胞内コンパートメントの RNA 標識に適用されていますが 18、内因性 POI の近接標識における戦略の再利用は未開発のままです。 ここでは、光活性化依存性近接標識 (PDPL) と呼ばれるプラットフォームを紹介します。このプラットフォームでは、青色光を使用して光増感剤 miniSOG 融合 POI を照射し、一重項酸素の生成をトリガーして近接残基を酸化し、続いて酸化された中間体をアミン含有アミンで修飾します。生細胞内の化学プローブ。 化学プローブのパネルをスクリーニングして標識特異性を最大化し、オープンサーチプロテオミクスワークフローを使用して修飾部位を決定します。 PDPL と TurboID を並べて比較すると、PDPL によるより特異的でより深いプロテオミクスの範囲が明らかになります。 我々は、このアプローチを細胞内プロテオームの細胞小器官特異的標識と、がん関連エピジェネティック調節タンパク質BRD4およびパーキンソン病関連E3リガーゼParkinの結合パートナーのプロテオームワイドな同定に適用し、既知および未報告のタンパク質相互作用因子のネットワークを検証します。 PDPL が大きなサイズのタンパク質複合体内の E3 基質を同定できるということは、間接結合剤の同定が必要なシナリオを表しています。 ユビキチン化プロテオソーム経路によって媒介される 2 つの未報告の Parkin 基質が in situ で検証されました。

光線力学療法 (PDT) 19 および発色団支援レーザー不活化 (CALI) 20 は、光増感剤の光照射によって一重項酸素が生成され、標的タンパク質を不活化したり、細胞死を引き起こしたりすることができます。 一重項酸素は理論上の拡散距離が約 70 nm の非常に反応性の高い種であるため 17,18,21、光増感剤の周囲で空間的に制限された酸化を制御できます。 この概念に基づいて、私たちは一重項酸素を利用して生細胞内のタンパク質複合体の近接標識を達成することにしました。 我々は、PDPL 化学プロテオミクス法を次の 4 つの特徴を具体化するように設計しました。(1) 酵素的 PL アプローチと同様の方法で、反応性一重項酸素を触媒的に生成します。 （２）光照射による開始により、時間的に分解されたラベリングを提供する。 （３）照射時間を変更してラベリング半径を調整することにより、空間分解ラベリングを可能にする。 (4) バックグラウンドを低減するための内因性補因子（例：ビオチン）の使用、または細胞環境への影響を最小限に抑えるために非常に摂動性の高い外因性試薬（例：過酸化物）の使用を避けます。

光増感剤は、小分子ベースの発蛍光団 (例: ローズベンガル、メチレンブルー) 22 と遺伝的にコードされた小タンパク質 (例: miniSOG、KillerRed) 23 の 2 つのカテゴリに分類できます。 モジュール設計を可能にするために、POI に光増感剤 (PS) タンパク質 24,25 を付加することにより、第一世代 PDPL プラットフォームを開発しました (図 1a)。 青色光照射後、一重項酸素は近位の求核性アミノ酸残基を酸化し、求電子極性をもたらし、アミンプローブ求核試薬とさらに反応することができます。 プローブはアルキン ハンドルを使用して設計されており、LC-MS/MS 特性評価のためのクリック ケミストリーとプルダウンが可能です。

miniSOG 媒介タンパク質複合体標識の概略図。 青色光を照射すると、miniSOG-POI 発現細胞は一重項酸素を生成し、非結合タンパク質ではなく相互作用タンパク質を修飾します。 光酸化中間体は、アミン化学プローブリレー標識によって遮断され、共有結合付加物を形成します。 化学プローブ上のアルキン基により、プルダウン濃縮のためのクリックケミストリーが可能になり、続いて LC-MS/MS による定量分析が可能になります。 b アミンプローブ 1 ～ 4 の化学構造。 c プローブ1〜4を使用したミトコンドリア局在miniSOG媒介プロテオーム標識の代表的な蛍光ゲル分析およびゲル濃度測定に基づく相対定量。 青色光を省略する、または miniSOG 発現のない HEK293T 細胞を使用したネガティブコントロール実験を使用して、化学プローブのシグナルからバックグラウンドへの標識を評価しました。 n = 2 生物学的に独立したサンプル。 各ドットは生物学的複製を表します。 d 示されたPDPL成分の存在下または非存在下で、cと同様の最適化されたプローブ3を使用した代表的なPDPLの検出および定量化。 n = 3 生物学的に独立したサンプル。 各ドットは生物学的複製を表します。 中心線とひげは平均値と±SDを示します。 CBB：クーマシーブリリアントブルー。 e 遠赤色色素 Si-DMA による一重項酸素の共焦点イメージング。 スケールバー: 10 μm。 ゲルイメージングと共焦点実験を独立して少なくとも 2 回繰り返し、同様の結果が得られました。

私たちは、化学プローブとしてプロパルギルアミンを使用して、プロテオミクス標識を媒介する能力について、HEK293Tで安定して発現した十分に開発された光増感剤miniSOG26およびKillerRed23をテストすることから始めました（補足図1a）。 ゲル内蛍光分析により、miniSOG と青色光照射によりプロテオーム全体の標識が達成される一方、KillerRed では明らかな標識生成物が観察されないことが明らかになりました。 シグナル対バックグラウンド比を高めるために、次にアニリン (1 および 3)、プロピルアミン (2)、またはベンジルアミン (4) のいずれかを含む化学プローブのパネルをテストしました。 おそらく内因性光増感物質リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド (FMN) の影響で、HEK293T 細胞単独では青色光の消失と比較してバックグラウンドシグナルが高いことに気づきました 27。 アニリンベースの化学プローブ 1 および 3 はより優れた特異性を示し、ミトコンドリアで miniSOG を安定的に発現する HEK293T ではプローブ 3 のシグナルが 8 倍を超える増加を示しましたが、RNA 標識法 CAP-seq で使用されたプローブ 2 では約 2.5 倍しか示されませんでした。おそらく RNA とタンパク質の間の反応性の好みの違いによるものと考えられます (図 1b、c)。 さらに、プローブ3とヒドラジンプローブの異性体（プローブ5、6、7）もテストされ、プローブ3が最適化されたものであることが確認されました（補足図1b、c）。 同様に、ゲル内蛍光分析により、他の最適化された実験パラメーター：照明波長（460 nm）、化学プローブ濃度（1 mM）、および照明時間（20分）が決定されました（補足図2a〜c）。 PDPLプロトコルのコンポーネントまたはステップを省略すると、シグナルからバックグラウンドへの大幅な逆戻りが発生しました（図1d）。 注目すべきことに、一重項酸素を消滅させることが知られているアジ化ナトリウムまたはトロロックスの存在下では、タンパク質の標識が大幅に減少しました28。 一重項酸素を安定化させることが知られている D2O の存在により、標識シグナルが強化されました。 標識に対する他の活性酸素種の寄与を調査するために、確立されたヒドロキシルラジカルおよびスーパーオキシドラジカルスカベンジャーであるマンニトールおよびビタミンCがそれぞれ添加されました18,29が、標識を減少させることは見つかりませんでした。 照明ではなくH2O2を追加すると、ラベリングを生成できませんでした（補足図3a）。 Si-DMA プローブによる一重項酸素の蛍光イメージングにより、HEK293T-miniSOG 株における一重項酸素の存在が確認されましたが、親 HEK293T 株には存在しませんでした。 さらに、mitoSOX Red は照明後のスーパーオキシドの生成を検出できませんでした（図 1e および補足図 3b）30。 これらのデータは、一重項酸素がその後のプロテオーム標識を引き起こす主要な ROS であることを強く示しています。 青色光照射および化学プローブ処理を含むPDPLの細胞毒性が評価されましたが、顕著な細胞毒性は観察されませんでした（補足図4a）。

標識メカニズムを調査し、LC-MS/MS によるタンパク質複合体のプロテオミクス同定を達成するには、まずどのアミノ酸が修飾されているか、およびプローブ標識のデルタマスを決定する必要がありました。 メチオニン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシンは一重項酸素によって修飾されることが報告されています14,15。 TOP-ABPP ワークフロー 31 を、MSFragger ベースの FragPipe 計算プラットフォーム 32 によって可能になる公平なオープン検索と統合しました。 一重項酸素修飾と化学プローブ標識の後、切断可能なリンカーを含むビオチン検索タグをクリックケミストリーに使用し、続いてニュートラアビジンプルダウンとトリプシン消化を行いました。 樹脂に結合したままの修飾ペプチドを、LC-MS/MS 分析のために光切断しました (図 2a および補足データ 1)。 50を超えるペプチドスペクトル一致（PSM）を伴うプロテオーム全体で発生する修飾の塊がリストされています（図2b）。 驚くべきことに、ヒスチジンの修飾のみが観察されました。これは、おそらく他のアミノ酸よりもアニリンプローブに対する酸化ヒスチジンの反応性が高いためと考えられます。 一重項酸素によるヒスチジン酸化の公表された機構 21,33 によれば、デルタ質量の推定構造 +229 Da は 2 回の酸化後のプローブ 3 と 2-オキソ-ヒスチジンの付加物に対応し、+247 Da は + の加水分解生成物です。 229 Da (補足図5)。 MS2スペクトルの評価により、修飾の同定を可能にしたフラグメントイオン（yおよびb）を含む、yイオンおよびbイオンの大部分が高信頼度で同定されたことが示されました（図2c）。 PDPL修飾ヒスチジンの局所配列コンテキストの分析により、±1位の小さな疎水性残基に対する適度なモチーフ優先性が明らかになりました（補足図4b）。 平均して、タンパク質あたり1.4のヒスチジンが同定され、これらの標識部位は溶媒アクセス可能表面積（SASA）および相対溶媒アクセス可能性（RSA）分析によって決定され、十分に露出しています（補足図4c、d）。

a MSFragger ベースの FragPipe 計算プラットフォームを使用して残基選択性を研究するための公平なワークフロー。 クリックケミストリーには切断可能なリンカーが使用され、これによりストレプトアビジン樹脂から修飾ペプチドの光切断が可能になります。 修飾の質量および対応する残基を特定するためにオープンサーチが展開されました。 b プロテオーム全体で発生する修飾の質量が割り当てられます。 PSM のペプチドスペクトルは一致します。 c プローブ 3 で修飾されたヒスチジン部位の MS2 スペクトルの注釈。 代表的な例として、プローブ 3 との共有結合反応により、修飾アミノ酸に +229.0938 Da が追加されます。 d PDPL標識を検証するための突然変異アッセイ。 PRDX3(H155A、H225A) および PRDX1(H10A、H81A、H169A) を、抗 Flag 検出のために野生型プラスミドとともにトランスフェクトしました。 e 合成ペプチドをプローブ 3 の存在下で精製した miniSOG と反応させ、Δm +247 および +229 をもつ対応する生成物に LC-MS スペクトルの注釈を付けました。 f miniSOG-6xHisタグと抗6xHis抗体によってシミュレートされたインビトロタンパク質間相互作用。 光照射時間に対するプローブ3標識miniSOG-6xHis/抗6xHis抗体複合体の抗ビオチン(ストレプトアビジン-HRP)および抗マウスウェスタンブロット分析。 個々のタンパク質の標識は適切な分子量で示されています。抗体の LC 軽鎖。 抗体のHC重鎖。 これらの実験は独立して少なくとも 2 回繰り返され、同様の結果が得られました。

標識部位を生化学的に検証するために、質量分析で同定された PRDX3 および PRDX1 のヒスチジンをアラニンに変異させ、トランスフェクション アッセイで野生型と比較しました。 PDPLの結果は、変異により標識が大幅に減少することを示しました（図2d）。 一方、オープンサーチで同定されたペプチド配列は合成され、プローブ3および青色光の存在下で精製されたminiSOGとin vitroで反応し、質量シフト+247および+229Daの生成物がLC-MS検出に現れました（図2e） ）。 in vitroでminiSOGの光活性化に応答して近接タンパク質相互作用物質を標識できるかどうかをテストするために、in vitroでminiSOG-6xHisタンパク質と抗Hisモノクローナル抗体との相互作用を介した人工近接アッセイを構築しました（図2f）。 このアッセイでは、miniSOG による抗体の重鎖と軽鎖の両方の近位標識が期待されました。 実際、抗マウス (抗 6xHis タグ抗体の重鎖と軽鎖の両方を認識) およびストレプトアビジン ウェスタンブロットでは、重鎖と軽鎖の強力なビオチン化が明らかになりました。 注目すべきことに、我々は、6xHisタグによるminiSOGの自己ビオチン化と、おそらく以前に報告されているリジンと2-オキソ-ヒスチジンの間の近接反応による軽鎖と重鎖の間の架橋に気づきました34。 総合すると、PDPL は近接依存的にヒスチジンを修飾すると結論付けました。

私たちの次の目的は、細胞内プロテオームを特徴づけて、その場での標識特異性をテストすることでした。 したがって、我々は、HEK293T細胞の核、ミトコンドリアマトリックス、またはER外膜にminiSOGを安定して発現させました（図3a）。 ゲル内蛍光分析により、豊富な標識バンドと、3 つの細胞内位置にわたる異なる標識パターンが明らかになりました (図 3b)。 蛍光イメージング分析により、PDPLの高い特異性が明らかになりました（図3c）。 ローダミン色素によるクリック反応に続く PDPL ワークフローを使用して、蛍光顕微鏡によって細胞内プロテオームを描写し、PDPL シグナルが DAPI、ミトコンドリア トラッカー、または ER トラッカーと共局在することにより、PDPL の高い忠実度が検証されました。 3 つの細胞小器官の位置について、抗ビオチン ウェスタン ブロットを使用した PDPL と TurboID の並べて比較により、それぞれのコントロールと比較して PDPL によるより特異的な標識が明らかになりました。 PDPL条件ではより多くの標識バンドが現れ、PDPLによってより多くの標識タンパク質が存在することを示しました（補足図6a-d）。

miniSOG 媒介オルガネラ特異的プロテオーム標識の概略図。 miniSOG は、ヒト COX4 の N 末端 23 アミノ酸への融合によってミトコンドリア マトリックス (mito-miniSOG)、H2B への融合によって核 (nucleus-miniSOG)、および ER 膜の細胞質側に遺伝子的に標的化されます。 Sec61β (ER-miniSOG) への融合。 読み出しには、ゲルイメージング、共焦点イメージング、および質量分析が含まれます。 b 3 つの細胞小器官特異的 PDPL プロファイルの代表的なゲルイメージング。 CBBクーマシーブリリアントブルー。 c V5タグ抗体（赤）で検出された、異なる細胞内局在miniSOGを安定的に発現するHEK293T細胞の代表的な共焦点イメージング。 ミトコンドリアとER (緑色) には細胞内マーカーが使用されます。 PDPL ワークフローには、Cy3-アジドを使用したクリックケミストリーを使用して、miniSOG 標識細胞内プロテオーム (黄色) を検出します。 スケールバー: 10 μm。 d ラベルフリー定量化によって定量化された、さまざまな細胞小器官におけるPDPL標識プロテオームのボルケーノプロット（n = 3の独立した生物学的実験）。 火山プロットでは両側スチューデント t 検定が使用されました。 野生型 HEK293T をネガティブコントロールとして使用しました。 大きく変化したタンパク質は赤色で強調表示されます (p < 0.05 および >2 倍のイオン強度差)。 HEK293T-miniSOG では重要であるが、HEK293T では重要ではない関連タンパク質は緑色でマークされています。 e dの実験から得られたプロテオミクスデータセットの特異性分析。 各細胞小器官内の統計的に有意なタンパク質の総数 (赤と緑の点) が上部に表示されます。 バーは、MitoCarta 3.0、GO 分析、および A. Ting et. に基づく細胞小器官局在タンパク質を示します。 アル。 それぞれミトコンドリア、核、ER のデータセット。 これらの実験は独立して少なくとも 2 回繰り返され、同様の結果が得られました。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

ゲルとイメージングの結果に勇気づけられて、ラベルフリーの定量化を使用して、各細胞小器官で同定されたプロテオームを定量化しました（補足データ 2）。 非トランスフェクトHEK293Tを陰性対照として使用して、バックグラウンド標識を差し引いた。 ボルケーノプロット分析では、大幅に濃縮されたタンパク質（p<0.05および>2倍のイオン強度）と、miniSOG発現株にのみ存在するシングルトンタンパク質が表示されました（図3dの赤と緑の点）。 これらのデータを組み合わせると、核、ミトコンドリア、ER 外膜についてそれぞれ統計的に有意なタンパク質が 1364、461、および 911 個同定されました。 細胞小器官局在化 PDPL の精度を分析するために、MitoCarta 3.0、遺伝子オントロジー (GO) 分析、および A. Ting et al. ミトコンドリア、核、およびERのデータセット8を使用して、検出されたタンパク質の細胞小器官特異性を検証しました。これは73.4、78.5、および73.0％の精度に相当しました（図3e）。 PDPL の特異性は、PDPL が細胞小器官特異的なプロテオームを同定するための理想的なツールであることを証明します。 注目すべきことに、同定されたミトコンドリアタンパク質のサブミトコンドリア分析により、捕捉されたプロテオームは主にマトリックスと内膜に分布しており（それぞれ226個と106個）、同定されたミトコンドリアタンパク質全体（362個）の91.7％を占めていることが明らかになり、このことはさらに高濃度であることを裏付けた。 -PDPLの忠実度（補足図7a）。 同様に、核下分析により、捕捉されたプロテオームが主に核、核質、および核小体に分布していることが明らかになりました（補足図7b）。 核局在シグナル（3xNLS）ペプチドによる核プロテオームプロファイリングは、H2Bコンストラクトと同様の精度を明らかにしました（補足図7c〜h）。 PDPL の標識特異性を定義するために、核ラミン A がより離散的に局在化した POI ベイトとして選択されました 7。 PDPL は 36 個の著しく濃縮されたタンパク質を同定し、そのうち 12 個のタンパク質 (30.0%、ラミン A を含む) は String データベースによって注釈が付けられた十分に特徴付けられたラミン A 相互作用タンパク質であり、BioID 法 (122 個のタンパク質のうち 28 個、22.9%) よりも高い割合を示しました。 7。 私たちの方法では、より反応性のある一重項酸素によって可能になった標識領域が制限されているため、同定されるタンパク質が少なくなりました。 GO 分析により、同定されたタンパク質は主に核質 (26)、核膜 (10)、核膜 (9)、および核孔 (5) に位置していることが明らかになりました。 組み合わせると、これらの核局在タンパク質は濃縮されたタンパク質の80％を占め、PDPLの特異性をさらに示しています（補足図8a-d）。

細胞小器官における近接標識に対する PDPL の能力を確立したので、我々は次に PDPL を使用して POI の結合パートナーをプロファイリングできるかどうかをテストしました。 特に、我々は細胞質タンパク質の PDPL プロファイリングを決定しようとしました。細胞質タンパク質は、その非常に動的な性質のため、膜局在の対応物と比較してより困難な標的とみなされていました 12。 ブロモドメインおよび末端外（BET）タンパク質 BRD4 は、さまざまな疾患におけるその重要な役割について私たちの注目を集めました 35,36。 BRD4 によって形成される複合体は転写コアクチベーターであり、重要な治療標的です。 BRD4 は、転写因子 c-myc および Wnt5a の発現を調節することにより、急性骨髄性白血病 (AML)、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、結腸癌、炎症性疾患の重要な決定因子と考えられています 37,38。 さらに、パピローマウイルス、HIV、SARS-CoV-236 など、いくつかのウイルスは BRD4 を標的にしてウイルスおよび細胞の転写を制御します。

PDPLを使用してBRD4の相互作用マップを決定するために、N末端またはC末端のいずれかでminiSOGをBRD4の短いアイソフォームに融合しました。 プロテオミクスの結果は、2つの構築物間の高度な重複を明らかにしました（補足図9a）。 miniSOG-H2Bによって決定された核プロテオームは、BRD4相互作用タンパク質の77.6％をカバーしていました（補足図9b）。 次に、異なる照明時点（2、5、10、20分）を使用して標識半径を調整しました（図4aおよび補足データ3）。 照射時間が短い場合、PDPLは主に直接結合パートナーを標識し、照射時間が長い場合は、より短い光活性化期間で同定されたタンパク質や複合体中の間接的な標的を標識する可能性があると推論しました。 実際、隣接する時点間で高い重複が見つかりました（2対5分で84.6％、5対10分で87.7％、10対20分で98.7％）（図4bおよび補足図9c）。 すべての実験グループで、BRD4 の自己標識だけでなく、文字列データベースに注釈が付けられている MED1、CHD8、BICRA、NIPBL、SMC1A、HMGB1 などの既知のターゲットのいくつかも検出されました。 これらのターゲットのイオン強度は照射時間に比例します（図4cおよび補足図9d）。 2 分グループで同定されたタンパク質の GO 分析により、同定されたタンパク質が核に局在し、クロマチンのリモデリングと RNA ポリメラーゼの機能に関与していることが明らかになりました。 タンパク質の分子機能は、BRD4の機能と一致して、クロマチン結合または転写共活性化において豊富でした（図4d）。 文字列データベースによって可能になったタンパク質相互作用分析により、BRD4とHDACの両方と一致して、BRD4とSIN3A、NCOR2、BCOR、SAP130などのHDACファミリー相互作用複合体間の間接的相互作用の最初の層が明らかになりました（図4eおよび補足図9e）。アセチル化ヒストンを結合します。 さらに、LC-MS/MSによって同定されたSin3A、NSUN2、Fus、およびSFPQを含む代表的な標的は、ウェスタンブロットによって検証されました（図4f）。 最近、BRD4 の短いアイソフォームが液液相分離 (LLPS) 特性を持つ核点を形成することが報告されました 40。 RNA 結合タンパク質 Fus および SFPQ は、さまざまな細胞プロセスの LLPS を媒介します 41 が、ここでは未報告の BRD4 結合タンパク質として同定されました。 免疫共沈降（co-IP）実験により、BRD4とSFPQの間の相互作用が検証されました（図4g）。これは、BRD4媒介の液液相分離の異なるメカニズムを示しており、さらなる研究が必要です。 総合すると、これらの結果は、PDPL が既知の BRD4 インタラクターおよび未報告の結合タンパク質を同定するための理想的なプラットフォームであることを示しています。

a 照射時間: 2、5、10、20 分の miniSOG 媒介 BRD4 近接標識の概略図。 b 異なる照射時点での同定されたタンパク質の重複。 同定されたタンパク質の濃縮は、野生型 HEK293T と比較して、HEK293T-miniSOG-BRD4 で統計的に有意です。 c 示された照射時間にわたる代表的な既知の BRD4 結合タンパク質のラベルフリー定量におけるイオン強度。 n = 3 生物学的に独立したサンプル。 データは平均値±SDとして表示されます。 d 2分グループで同定されたタンパク質の遺伝子オントロジー（GO）分析。 GO 用語のトップ 10 がリストされています。 バブルは GO 用語クラスに従って色付けされ、バブルのサイズは各用語で見つかったタンパク質の数に比例します。 e BRD4相互作用タンパク質の文字列分析。 黄色の丸は直接バインダーであり、灰色の丸は間接バインダーの最初の層にあります。 赤い線は実験的に決定された相互作用を示し、シアンの線は予測された相互作用を示します。 f LC-MS/MS で同定された代表的な BRD4 結合標的は、ウェスタンブロットを使用して検証されました。 g 免疫共沈降実験により、SFPQ と BRD4 の間の相互作用が検証されました。 これらの実験は独立して少なくとも 2 回繰り返され、同様の結果が得られました。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

我々は、POI の未報告の結合標的の同定に加えて、PDPL が酵素の基質の同定にも適していると考えました。これには、未報告の基質に注釈を付けるために大きな複合体中の間接結合タンパク質の特性評価が必要です。 Parkin (PARK2 によってコードされる) は E3 リガーゼであり、Parkin の変異は常染色体劣性若年性パーキンソン病 (AR-JP) を引き起こすことが知られています 42。 さらに、パーキンはマイトファジー (ミトコンドリアのオートファジー) と活性酸素種のクリアランスに重要であると記載されています 43。 しかし、パーキンの基質のいくつかが同定されているにもかかわらず、この病気におけるパーキンの機能は不明です。 特徴付けられていない基質に注釈を付けるために、PDPL を Parkin の N または C 末端に miniSOG を組み込むことによってテストしました。 細胞をプロトノフォア シアン化カルボニル m-クロロフェニル ヒドラゾン (CCCP) で処理し、PINK1-パーキン経路を介してパーキンを活性化しました。 BRD4 PDPLの結果とは対照的に、Parkin N末端融合は、C末端の大部分（210のうち177）をカバーしているにもかかわらず、はるかに大きなタンパク質標的セットを同定しました（図5a、bおよび補足データ4）。 。 この結果は、N 末端タグ付けが Parkin44 を異常に活性化する可能性があるという報告と一致しています。 驚くべきことに、我々のデータには、公開されている Parkin43 の AP-MS 結果と重複するタンパク質が 18 個しかありません。これは、細胞株とプロテオミクス ワークフローの違いによるものと思われます。 PDPL は、両方のアプローチで同定された 4 つの既知のタンパク質 (ARDM1、HSPA8、PSMD14) に加えて、11 の既知のパーキン結合物質 (ATXN2、IKBKG、PSMD4、TP53、SUMO1、PSMD9、STUB1、PSMD4、DNAJB1、UBE2Z、および EPS15) を排他的に同定できました。 、および PSMC3) (図 5c)43。 LC-MS/MS の結果をさらに検証するために、PDPL 処理とその後のウェスタンブロット分析を使用して、親 HEK293T 細胞と N 末端 Parkin 安定株のプルダウン結果を比較しました。 これまで知られていなかったターゲットであるCDK2、DUT、CTBP1、およびPSMC4が、既知のバインダーDNAJB1とともに検証されました（図5d）。

a ParkinのN末端またはC末端に融合して安定発現したminiSOGを含むHEK293T細胞におけるParkin相互作用タンパク質のボルケーノプロット（n = 3の独立した生物学的実験）。 火山プロットでは両側スチューデント t 検定が使用されました。 HEK293Tを陰性対照として使用した。 大きく変化したタンパク質は赤色で強調表示されます (p < 0.05 および >2 倍のイオン強度差)。 HEK293T-miniSOG では重要であるが、HEK293T では重要ではない関連タンパク質は緑色でマークされています。 b N末端構築物とC末端構築物の間で重複するタンパク質を示すベン図。 N 末端タグ付けにより、Parkin が異常に活性化され、より多くのタンパク質が同定される可能性があります。 c PDPLとAP-MSの間で重複するタンパク質を示すベン図。 既知の相互作用因子がリストされており、これには 18 の重複タンパク質のうちの 4 タンパク質、および PDPL で排他的に同定された 159 タンパク質のうち 11 のタンパク質が含まれます。 d LC-MS/MS によって同定された代表的な標的は、ウェスタンブロットを使用して検証されました。 e Ssu72 および SNW1 は、報告されていない Parkin の基質として同定されました。 FLAG で標識されたこれらのタンパク質を含むプラスミドを HEK293T および HEK293T-Parkin-miniSOG にトランスフェクトし、その後、さまざまな時点で CCCP 処理しました。 分解は、パーキン過剰発現株においてより顕著である。 f Ssu72 および SNW1 の分解プロセスは、プロテアソーム阻害剤 MG132 を使用することにより、ユビキチン化プロテアソーム経路によって媒介されることが確認されました。 これらの実験は独立して少なくとも 2 回繰り返され、同様の結果が得られました。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

特に、PDPLによって同定されるタンパク質には、パーキンの結合タンパク質およびその基質が含まれるはずです。 報告されていない Parkin の基質を発見するために、7 つの同定されたタンパク質 (PUF60、PSPC1、UCHL3、PPP1R8、CACYBP、Ssu72、および SNW1) とトランスフェクトされたプラスミドを選択し、これらの遺伝子を正常な HEK293T および miniSOG-Parkin を安定に発現する HEK293T に導入しました。 CCCP治療。 Ssu72およびSNW1タンパク質レベルは、miniSOG-Parkin安定系統で大幅に減少しました（図5e）。 12 時間の CCCP 処理により、両方の基材が最も顕著に劣化しました。 Ssu72とSNW1の分解がユビキチン化プロテアソーム経路によって調節されているかどうかを調べるために、プロテアソーム阻害剤MG132を追加してプロテアソーム活性を阻害したところ、実際にそれらの分解プロセスが阻害されたことがわかりました（図5f）。 他の非基質ターゲットは、ウェスタンブロットを使用してパーキンの相互作用物質として検証され（補足図10）、LC-MS/MSで一貫した結果が示されました。 総合すると、PDPL ワークフローと標的タンパク質トランスフェクション検証を統合することで、報告されていない E3 リガーゼの基質を特定できます。

我々は、POI のインタラクターを時空間分解して識別できる汎用近接ラベリング プラットフォームを開発しました。 このプラットフォームは、わずか約 12 kD の光増感タンパク質 miniSOG に基づいており、よく開発された酵素 APEX2 (27 kD) の半分以下、TurboID (35 kD) の 3 分の 1 のサイズです。 サイズが小さくなることにより、小さなタンパク質のインタラクトームを研究するための応用範囲が大幅に拡大されるはずです。 一重項酸素量子収量を増加させ、このアプローチの感度を拡大するには、遺伝的にコードされたタンパク質または小分子 45 の両方である追加の光増感剤の将来の探索が保証されます。 現在の miniSOG バージョンでは、青色光照明を使用して近接ラベリングを開始することで、高い時間分解能が可能になります。 さらに、照射時間が長くなると、より大きな一重項酸素の「雲」が放出され、より遠位のヒスチジン残基が修飾され、標識半径が拡大し、PDPL の空間分解能の微調整が可能になります。 また、シグナル対バックグラウンド比を高めるために 7 つの化学プローブをスクリーニングし、このアプローチの根底にある分子機構を調査しました。 TOP-ABPP ワークフローと不偏オープン検索を組み合わせたところ、修飾はヒスチジンでのみ発生し、ループ領域でのヒスチジンが適度に優先されること以外に、ヒスチジン修飾の増加に一貫した微環境は観察されないことが確認されました。

PDPL は細胞内プロテオームの特性評価にも利用され、その特異性とプロテオームの適用範囲は他の近接標識法や細胞小器官特異的な化学プローブに基づく方法と少なくとも同等でした。 近接標識は、サーファコーム、リソソーム プロテオーム、分泌経路関連プロテオームの特性評価にも適用されています 46,47。 私たちは、PDPL がこれらの細胞内小器官と適合すると考えています。 さらに、我々は、サイトゾルタンパク質結合標的の同定においてPDPLに挑戦しましたが、これは、その動的な性質とより一時的な相互作用への関与により、膜結合タンパク質よりも困難です。 PDPL は、転写コアクチベーター BRD4 と疾患関連 E3 リガーゼ Parkin の 2 つのタンパク質に適用されました。 これら 2 つのタンパク質は、基本的な生物学的機能だけでなく、臨床的関連性と治療の可能性も考慮して選択されました。 両方の POI について、既知の結合パートナーと未報告のターゲットが同定されました。 特に、相分離関連タンパク質SFPQがco-IPによって検証されたことは、BRD4（短いアイソフォーム）がLLPSを制御する新しい機構を示している可能性がある。 一方、パーキン基質の同定は、間接結合体の同定が必要となるシナリオであると我々は考えています。 私たちは、報告されていない 2 つの Parkin 基質を同定し、ユビキチン化 - プロテオソーム経路によるそれらの分解を検証しました。 ごく最近、酵素で基質を捕捉することによって加水分解酵素基質を発見するための機構に基づくトラップ戦略が開発されました48。 非常に強力なアプローチではありますが、大きな複合体の形成に関与する基質のプロファイリングには適しておらず、酵素と基質の間に共有結合を形成する必要があります。 我々は、PDPL が他のタンパク質複合体や脱ユビキチン化酵素やメタロプロテアーゼファミリーなどの酵素ファミリーの研究に拡張される可能性があると予想しています。

SOPP3 と呼ばれる新しい形式の miniSOG は、一重項酸素収率が向上するように設計されています 49。 miniSOG を SOPP3 と比較したところ、信号対雑音比は変化しなかったものの、標識効率が向上していることがわかりました（補足図 11）。 SOPP3の最適化（例えば、指向性進化による）により、はるかに短い照射時間を必要とするより効率的な光増感タンパク質が得られ、より動的な細胞プロセスの捕捉が可能になると我々は仮定する。 特に、PDPLの現在のバージョンは、深部組織を透過できない青色光照明を必要とするため、細胞環境に限定されています。 この特徴により、動物モデル研究での利用が妨げられます。 しかし、PDPL と組み合わせた光遺伝学技術は、特に脳における動物研究 50 に道を提供する可能性があります。 さらに、他の人工赤外線光増感剤もこの制限を軽減するでしょう。 この方向の研究は現在進行中です。

HEK293T 細胞株は ATCC (CRL-3216) から入手しました。 この細胞株はマイコプラズマ汚染が陰性であることが検査されており、10% ウシ胎児血清 (FBS、Vistech、#SE100-B) および 1% ペニシリン/ストレプトマイシン (Hyclone、#SV30010) を添加した DMEM (Thermo、#C11995500BT) で培養されました。 。

3-アミノフェニレン (プローブ 3) および (4-エチニルフェニル) メタンアミン (プローブ 4) は Bidepharm から購入しました。 プロピルアミン (プローブ 2) は Energy-chemicals から購入しました。 N-(2-アミノフェニル)ペント-4-インアミド (プローブ 1) は、公開されている手順 51 に従って合成されました。

補足表 1 に、この研究で使用した遺伝子構築物を示します。 miniSOG および KillerRed 配列は、P. Zou (北京大学) からのギフト プラスミドからクローン化されました。 ミトコンドリア マトリックス ターゲティング配列は COX4 の N 末端 23 アミノ酸に由来し、Gibson アセンブリ (Beyotime、#D7010S) によって特定のベクターにクローン化されました。 小胞体膜および核への標的化に関しては、HEK293T 細胞 cDNA ライブラリーから PCR (NEB、#M0491L) によって増幅されたヒト SEC61B (NM_006808.3) DNA および H2B DNA (深セン湾研究所の D. Lin からの贈り物) を使用しました。上記のようにクローン化されました。 トランスフェクションおよび安定な細胞株構築に使用される他のタンパク質遺伝子は、特に記載がない限り、HEK293T 細胞 cDNA ライブラリーから PCR によって増幅されました。 G3S (GGGS) および G4S (GGGGS) をベイトタンパク質と miniSOG の間のリンカーとして使用しました。 V5 エピトープ タグ (GKPIPNPLLGLDST) をこれらの融合構築物に追加しました。 哺乳類の発現および安定な細胞株の作製のために、miniSOG 融合構築物をレンチウイルス ベクター pLX304 にサブクローニングしました。 細菌発現のために、miniSOG を C 末端に 6xHis タグを持つ pET21a ベクターにクローニングしました。

HEK293T 細胞を 6 ウェルプレートにウェルあたり 2.0 × 105 細胞で播種し、24 時間後に、Lipo8000 を使用して組換えレンチウイルス プラスミド (2.4 μg pLX304) およびウイルス パッケージング プラスミド (1.5 μg psPAX2 および 1.2 μg pMD2.G) をトランスフェクトしました ( Beyotime、#C0533) コンフルエンシー約 80%。 一晩トランスフェクションした後、培地を交換し、さらに 24 時間インキュベートしました。 ウイルスの収集は 24、48、および 72 時間の時点で実行されました。 ウイルス培地を0.8μmフィルター(Merck、#millex-GP)で濾過し、標的細胞株の感染前にポリブレン(Solarbio、#H8761)を8μg/mLの濃度で添加した。 24時間後、培地を交換することによって細胞を回復させた。 最初の 3 継代では、より低いストリンジェンシーの選択として、5 μg/mL のブラストサイジン (Solarbio、#3513-03-9) を用いて細胞を選択しました。 次に、次の 3 継代では、より高いストリンジェンシーとして 20 μg/mL を使用しました。

細胞を 12 ウェルチャンバー (Ibidi、#81201) にウェルあたり約 20,000 細胞の密度で播種しました。 HEK293T 細胞の接着を改善するために、チャンバーをリン酸緩衝生理食塩水 (PBS、Sangon、#B640435) で希釈した 50 μg/ml フィブロネクチン (Corning、#356008) で 37 °C で 1 時間前処理し、PBS で除去しました。 24 時間後、細胞を PBS で 1 回洗浄し、新鮮なハンクス平衡塩類溶液 (HBSS、Gibco、#14025092) 中で 1 mM プローブ 3 とともに 37 °C で 1 時間インキュベートし、その後青色 LED (460 nm) で 10 分間照射しました。室温で1分。 その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒド（Ｓａｎｇｏｎ、＃Ｅ６７２００２）を用いて室温で１５分間固定した。 PBSで3回洗浄することにより、固定細胞から過剰なホルムアルデヒドを除去した。 次いで細胞をＰＢＳ中の０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓａｎｇｏｎ、＃Ａ６００１９８）で透過処理し、次いでＰＢＳでさらに３回洗浄した。 次に、チャンバーを取り外し、50 μM C​​y3-アジド (Aladdin、#C196720)、2 mM CuSO4 (Sangon、#A603008)、1 mM BTTAA (Confluore、#BDJ) を含むクリック反応試薬の混合物 25 μL を各サンプルに加えました。 -4) および 0.5 mg/ml アスコルビン酸ナトリウム (Aladdin、#S105024) を加え、室温で 30 分間インキュベートしました。 クリック反応後、細胞を0.05% Tween-20 (Sangon、# A600560) (PBST)を含むPBSで6回洗浄し、次にPBST中の5% BSA (Abcone、#B24726)で室温で30分間ブロックしました。

共局在解析を可能にする免疫染色では、示された条件に従って細胞を一次抗体とインキュベートしました: 抗 V5 タグ マウス モノクローナル抗体 (1:500、CST、#80076)、抗 Hsp60 ウサギ モノクローナル抗体 (1:1000、ABclonal、 #A0564)、抗カルネキシン ウサギ ポリクローナル抗体 (1:500、Abcam、#ab22595)、または抗ラミン A/C ウサギ モノクローナル抗体 (1:500; CST、#2032) を 4 °C で一晩投与しました。 PBSTで3回洗浄した後、細胞を二次抗体とともにインキュベートしました：ヤギ抗ウサギAlexa Fluor 488 (Thermo、#A11034) 1:1000希釈、ヤギ抗マウスAlexa Fluor 594 (CST、#8889) 1:1000室温で 30 分間希釈します。 次いで、細胞をＰＢＳＴで３回洗浄し、室温で１０分間、ＰＢＳ中のＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ、＃Ｄ１３０６）で対比染色した。 細胞は、ＰＢＳで３回洗浄した後、イメージングのためにＰＢＳ中の５０％グリセロール（Ｓａｎｇｏｎ、＃Ａ６００２３２）中に密封された。 免疫蛍光画像は、ソフトウェア ZNE 3.5 を備えた ZEISS LSM 900 Airyscan2 共焦点顕微鏡で収集されました。

一重項酸素の蛍光イメージングでは、細胞をハンクス HEPES 緩衝液で 2 回洗浄し、その後ハンクス HEPES 緩衝液中の 100 nM Si-DMA (DOJINDO、#MT05) を添加しました。 照明後、細胞を 37 °C の CO2 インキュベーター内で 45 分間培養しました。 その後、細胞をハンクスHEPES緩衝液で2回洗浄し、室温で10分間、ハンクスHEPES緩衝液中のヘキストで対比染色し、ZEISS LSM 900共焦点顕微鏡で画像化した。 スーパーオキシドの蛍光イメージングのために、カルシウムとマグネシウムを含む HBSS 緩衝液中の 5 μM MitoSOX™ レッド ミトコンドリア スーパーオキシド インジケーター (Invitrogen、#M36008) を細胞に添加しました。 照明またはドキソルビシン (MCE、#HY-15142A) 処理後、細胞を CO2 インキュベーター内で 37 °C で 10 分間培養し、HBSS バッファーで 2 回洗浄し、室温で 10 分間、HBSS バッファー中の Hoechst で対比染色しました。 ドキソルビシンをプローブのポジティブコントロールとして使用し、細胞を1% BSAを含むHBSS中の20μMドキソルビシンで30分間処理した。 免疫蛍光画像は、ZEISS LSM 900 共焦点顕微鏡で収集されました。

mito-miniSOG を安定して発現する HEK293T 細胞を 15 cm ディッシュに約 30% の密度で播種しました。 48 時間後、コンフルエントが約 80% に達したら、細胞を PBS で 1 回洗浄し、新鮮な HBSS バッファー中の 1 mM プローブ 3 とともに 37 °C で 1 時間インキュベートし、次に青色 LED で室温で 10 分間照射しました。 その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、こすり取り、ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤（ＭＣＥ、＃ＨＹ－Ｋ００１１）を含む氷冷ＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。 細胞をチップ超音波処理により１分間溶解した（１秒間オンおよび１秒間オフ、振幅３５％）。 得られた混合物を15,871×g、4℃で10分間遠心分離して破片を除去し、BCAタンパク質アッセイキット(Beyotime、#P0009)を使用して上清の濃度を4 mg/mLに調整した。 上記のライセート 1 mL を、0.1 mM 光切断可能なビオチンアジド (Confluore、#BBBD-14)、1 mM TCEP (Sangon、#A600974)、0.1 mM TBTA (Aladdin、#T162437) リガンド、および 1 mM とインキュベートしました。室温でボトムアップ回転させながら CuSO4 を 1 時間処理します。 クリック反応後、混合物を 10 mL ガラス瓶内のあらかじめ混合した溶液 (MeOH: CHCl3: H2O = 4 mL: 1 mL: 3 mL) に加えました。 サンプルを混合し、室温で 4500 xg で 10 分間遠心分離しました。 下層および上層の溶液を順次廃棄し、続いてペレットを1 mLのメタノールで2回洗浄し、続いて15,871×gで5分間、4℃で遠心分離した。 ２５ｍＭ重炭酸アンモニウム（ＡＢＣ、Ａｌａｄｄｉｎ、＃Ａ１１０５３９）中の８Ｍ尿素（Ａｌａｄｄｉｎ、＃Ｕ１１１９０２）１ｍＬを添加して、ペレットを溶解した。 サンプルを、10 mM ジチオスレイトール (Sangon、#A100281、25 mM ABC中) で 55 °C で 40 分間還元し、次に 15 mM の新鮮なヨードアセトアミド (Sangon、#A600539) を暗所、室温で 30 分間加えてアルキル化しました。 さらに５ｍＭのジチオスレイトールを加えて反応を停止させた。 各サンプルについて約１００μＬのニュートラアビジンアガロース樹脂ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ、＃２９２０２）を、１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄することによって調製した。 上記のプロテオーム溶液を 5 mL PBS で希釈し、あらかじめ洗浄した NeutrAvidin アガロース樹脂ビーズとともに室温で 4 時間インキュベートしました。 次に、ビーズを、０．２％ ＳＤＳ（Ｓａｎｇｏｎ、＃Ａ６００４８５）を含む５ｍＬのＰＢＳで３回、１Ｍ尿素を含む５ｍＬのＰＢＳで３回、そして５ｍＬのｄｄＨ２Ｏで３回洗浄した。 次いで、ビーズを遠心分離によって回収し、１Ｍ尿素、１ｍＭ ＣａＣｌ２（Ｍａｃｋｌｉｎ、＃Ｃ８０５２２８）、および２０ｎｇ／μＬトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｖ５２８０）を含有する２００μＬの２５ｍＭ ＡＢＣ中に再懸濁した。 トリプシン消化は、37 °C で一晩回転させながら実行されました。 pH が 2 ～ 3 に達するまでギ酸 (Thermo、# A117-50) を加えて反応を停止させました。 ビーズを、０．２％ＳＤＳを含む１ｍｌのＰＢＳで３回、１Ｍ尿素を含む１ｍｌのＰＢＳで３回、次いで１ｍｌの蒸留水で３回洗浄した。 200 μL 70% MeOH による 90 分間の光 (365 nm) 切断による修飾ペプチドの放出。 遠心分離後、上清を回収した。 次いで、ビーズを100μLの70% MeOHで1回洗浄し、上清を合わせた。 サンプルを Speedvac 真空濃縮器で乾燥し、分析まで -20 °C で保管しました。

一重項酸素修飾ペプチドの同定と定量のために、サンプルを 0.1% ギ酸に再溶解し、ベンダー提供の Tune および Xcalibur を備えたナノ ESI 源を備えた Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質量分析計で 1 μg のペプチドを分析しました。 4.3 ソフトウェア。 サンプルは、3 μm C18 材料 (ReproSil-pur、#r13.b9.) を社内で充填した 75 μm × 15 cm キャピラリー カラムで分離し、EASY-nLC 1200 UHPLC システム (Thermo) に接続しました。 ペプチドは、溶媒 B 8 ～ 50% の 95 分間の直線勾配 (A = 0.1% ギ酸水溶液、B = 0.1% ギ酸 / 80% アセトニトリル) でクロマトグラフィーにより分離し、その後 6 分間で 98% B まで直線的に増加させました。 300 nL/分の流速で分。 Orbitrap Fusion Lumos は、フルスキャン MS スキャンと MS2 スキャンを交互に行うデータ依存の方法でデータを取得しました。 スプレー電圧は 2.1 kV に設定され、イオン移動キャピラリーの温度は 320 °C でした。 MS スペクトル (350 〜 2000 m/z) は、120,000 の解像度、4 × 105 の AGC、および 150 ms の最大注入時間で収集されました。 各フルスキャンからの最も豊富な多価前駆体上位 10 個は、30% 正規化衝突エネルギー、1.6 m/z の四重極分離ウィンドウ、および 30,000 の解像度設定を使用して HCD によって断片化されました。 タンデム質量スペクトルの 5 × 104 および 150 ms の最大注入時間の AGC ターゲットを使用しました。 動的除外は 30 秒に設定されました。 未割り当てのイオン、または 1+ および >7+ の電荷を持つイオンは、MS/MS では拒否されました。

生データは、MSFragger ベースの FragPipe 計算プラットフォームを使用して処理されました32。 前駆体質量許容範囲 -150 ～ 500 Da のオープン検索アルゴリズムを使用して、質量シフトと対応するアミノ酸を決定しました。 次に、デルタ質量 +229.0964 および +247.1069 Da のヒスチジンの修飾を PD (proteome Discoverer 2.5、Thermo) で使用して、修飾ペプチドを同定しました。

miniSOG融合遺伝子を安定して発現する細胞を6cmディッシュに播種しました。 約80％コンフルエントに達したら、細胞をHBSS（Gibco、#14025092）で1回洗浄し、続いてHBSS中で化学プローブとともに37℃で1時間インキュベートし、室温で20分間10Wの青色LEDで照明しました。 どのタイプの活性酸素種が PDPL に関与しているかを判断するには、0.5 mM ビタミン C (MCE、#HY-B0166)、5 mM Trolox (MCE、#HY-101445)、D2O (Sigma、#7789-20-0)、 １００ｍＭのマンニトール（Ｅｎｅｒｇｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、＃６９−６５−８）、１００μＭのＨ２Ｏ２、１０ｍＭのＮａＮ３を添加剤として細胞に加えた。 冷 PBS ですすいだ後、細胞をこすり取り、1.5 mL 遠心分離管に集め、1x EDTA フリー プロテアーゼ阻害剤を含む 200 μL PBS 中でチップ超音波処理を 1 分間使用して溶解しました (1 秒オンと 1 秒オフ、振幅 35%)。 。 得られた混合物を15,871×g、4℃で10分間遠心分離し、BCAタンパク質アッセイキットを使用して上清の濃度を1 mg/mLに調整しました。 上記のライセート約 50 μL を、0.1 mM ローダミンアジド (Aladdin、#T131368)、1 mM TCEP、0.1 mM TBTA リガンド、および 1 mM CuSO4 とともに、室温でボトムアップ回転させながら 1 時間インキュベートしました。 クリック反応後、250 μL の予冷アセトンをサンプルに添加し、-20 °C で 20 分間インキュベートし、4 °C で 6010 xg で 10 分間遠心分離することにより、アセトン沈殿を実行しました。 ペレットを収集し、50μLの1x Laemmli緩衝液中で95℃で10分間煮沸した。 次に、サンプルを SDS-PAGE ロングゲルで泳動し、Image Lab Touch ソフトウェアを備えた Bio-rad ChemiDoc MP Touch イメージング システムによって視覚化しました。

miniSOG-6xHis 組換えタンパク質の発現と精製は、以前に記載されているように実行されました 18。 簡単に説明すると、大腸菌 BL21(DE3) (TransGen、#CD701-02) 細胞を pET21a-miniSOG-6xHis で形質転換し、0.5 mM IPTG (Sangon、#A600168) によってタンパク質発現を誘導しました。 細胞溶解後、タンパク質は Ni-NTA アガロース ビーズ (MCE、#70666) を介して精製され、PBS に対して透析され、-80 °C で保存されました。

インビトロでの抗体ベースの近接標識アッセイでは、100 μM 精製 miniSOG、1 mM プローブ 3、および 1 μg 抗 His タグ マウス モノクローナル抗体 (TransGen、#HT501-01) を PBS 中で混合し、総反応量 50 μL にしました。 反応混合物に青色 LED 光を室温で 0、2、5、10、および 20 分間照射しました。 混合物を、0.1 mM ビオチン-PEG3-アジド (Aladdin、#B122225)、1 mM TCEP、0.1 mM TBTA リガンド、および 1 mM CuSO4 とともにボトムアップシェーカー上で室温で 1 時間インキュベートしました。 クリック反応後、4x Laemmli バッファーを混合物に直接添加し、95 °C で 10 分間煮沸しました。 サンプルを SDS-PAGE ゲル上で泳動し、ストレプトアビジン-HRP (1:1000、Solarbio、#SE068) ウェスタンブロットによって分析しました。

インビトロでのペプチドベースの近接標識アッセイでは、C 末端がアミド化されたヒスチジン含有合成ペプチド (LHDALDAK-CONH2) が使用されました。 このアッセイでは、100 μM 精製 miniSOG、10 mM プローブ 3、および 2 μg/mL 合成ペプチドを PBS 中で混合し、総反応量を 50 μL にしました。 反応混合物に青色LED光を室温で1時間照射した。 1 マイクロリットルのサンプルを LC-MS システム (Waters、MassLynx スペクトル分析ソフトウェアを備えた SYNAPT XS イオン移動度飛行時間型質量分析計) によって分析しました。

miniSOG 融合遺伝子を安定的に発現する HEK293T 細胞を、さまざまな細胞小器官局在系統 (Mito、ER、Nucleus) については 10 cm ディッシュに、Parkin-miniSOG および BRD4-miniSOG 系統については 15 cm ディッシュに播種しました。 約90％コンフルエントに達したら、細胞をHBSSで1回洗浄し、その後HBSS中でプローブ3とともに37℃で1時間インキュベートし、室温で示されているように10Wの青色LEDで照明しました。 Parkin近接標識では、10μMのプロトノフォアカルボニルシアン化物m-クロロフェニルヒドラゾンCCCP（Solarbio、#C6700）をプローブ3とともにHBSS中で37℃で1時間添加した。 細胞溶解、クリックケミストリー、還元、およびアルキル化のステップは、2 mg のライセートを入力し、光切断可能なビオチンアジドの代わりにビオチン PEG3 アジドをクリック反応で使用したことを除いて、上記と同じでした。 ビーズ濃縮後、ビーズを0.2% SDSを含む5 mL PBSで3回、1 M 尿素を含む5 mL PBSで3回、そして5 mL PBSで3回洗浄した。 その後、1 M 尿素を含む 25 mM ABC 300 μL 中のトリプシン 2 μg を添加し、37 °C で一晩タンパク質を消化しました。 pHが2～3に達するまでギ酸を加えて反応を停止させた。 オンビーズのトリプシン消化後、SOLAμ HRP カラム (Thermo、#60209-001) を使用してペプチド溶液を脱塩し、speedvac 真空濃縮器で乾燥させました。 ペプチドを 0.1% ギ酸に再溶解し、500 ng のペプチドを、上記のナノ ESI 源を備えた Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質量分析計で分析しました。 ペプチドは、市販の RP-HPLC プレカラム (75 μm × 2 cm) (Thermo、#164946) および RP-HPLC 分析カラム (75 μm × 25 cm) (Thermo、#164941) で分離されました。 μm C18 ビーズでは、60 分間で 8 ～ 35% ACN の範囲の直線勾配を使用し、その後 300 nL/min の流速で 6 分間で 98% B まで直線的に増加します。 MS スペクトル (350 〜 1500 m/z) は、解像度 60,000、AGC 4 × 105、最大注入時間 50 ms で収集されました。 選択されたイオンは、30% 正規化衝突エネルギー、1.6 m/z の四重極分離ウィンドウ、および 15,000 分解能を備えた HCD によって 3 秒サイクルで連続的にフラグメント化されました。 タンデム質量スペクトルの 5 × 104 および 22 ms の最大注入時間の AGC ターゲットを使用しました。 動的除外は 45 秒に設定されました。 未割り当てのイオン、または 1+ および >7+ の電荷を持つイオンは、MS/MS では拒否されました。

NeutrAvidin ビーズ濃縮までのサンプル調製手順は、上記の LC-MS/MS 分析と同じでした。 約 50 μg のライセートをローディング コントロール入力として使用し、2 mg のライセートをクリック反応に使用しました。 NeutrAvidin の濃縮と洗浄後、アガロース樹脂ビーズに 50 µL Laemmli 緩衝液を加え、95 °C で 5 分間煮沸することによって結合タンパク質を溶出しました。 ローディングコントロールインプットおよびビーズ富化サンプルをSDS-PAGEで分析し、標準的なウェスタンブロッティング法によってPVDF膜(Millipore、#ISEQ00010)に転写した。 膜を、0.1% tween-20 を含む TBS (TBST) 中の 5% 無脂肪乳 (Sangon、#A600669) 中でブロックし、一次抗体および二次抗体と連続してインキュベートしました。 一次抗体は、TBST 中の 5% 無脂肪乳で 1:1000 に希釈して使用し、4 °C で一晩インキュベートしました。 二次抗体を 1:5000 で使用し、室温で 1 時間インキュベートしました。 膜は、Chemidoc MP イメージング システムによる化学発光を使用して視覚化されました。 図内のすべてのブロットおよびゲルのトリミングされていないスキャンがソース データとして提供されます。

この研究で使用される一次抗体には、抗 SFPQ ウサギ モノクローナル抗体 (CST、#71992)、抗 FUS ウサギ モノクローナル抗体 (CST、#67840)、抗 NSUN2 ウサギ ポリクローナル抗体 (Proteintech、#20854-1-AP)、抗mSin3Aウサギポリクローナル抗体（アブカム、#ab3479）、抗Flagタグマウスモノクローナル抗体（TransGen、#HT201-02）、抗β-アクチンマウスモノクローナル抗体（TransGen、#HC201-01）、抗CDK2ウサギモノクローナル抗体 (ABclonal、#A0094)、抗 CTBP1 ウサギモノクローナル抗体 (ABclonal、#A11600)、抗 DUT ウサギポリクローナル抗体 (ABclonal、#A2901)、抗 PSMC4 ウサギポリクローナル抗体 (ABclonal、#A2505)、 DNAJB1 ウサギ ポリクローナル抗体 (ABclonal、#A5504)。 これらの抗体は、TBST 中の 5% 無脂肪乳で 1:1000 に希釈して使用しました。 この研究で使用される二次抗体には、1:5000 希釈の抗ウサギ IgG (TransGen、#HS101-01)、抗マウス IgG (TransGen、#HS201-01) が含まれます。

BRD4がSFPQと相互作用するかどうかをさらに調べるために、HEK293TおよびHEK293Tを過剰発現するBRD4-miniSOG安定細胞を10cmディッシュに播種しました。 細胞を冷PBSで洗浄し、1x EDTAフリープロテアーゼ阻害剤を含む1 ml Pierce IP Lysis Buffer (Thermo Fisher、#87787)中で4℃で30分間溶解しました。 その後、溶解物を 1.5 mL 遠心分離管に収集し、15,871 xg、4 °C で 10 分間遠心分離しました。 上清を収集し、5 μg の抗 V5 タグ マウス モノクローナル抗体 (CST、#80076) とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。 約50μLのプロテインA/G磁気ビーズ(MCE、#HY-K0202)を0.5% tween-20を含むPBSで2回洗浄した。 続いて、細胞溶解物を磁気ビーズとともにボトムアップ回転させながら4℃で4時間インキュベートしました。 次に、ビーズを 1 mL PBST 緩衝液で 4 回洗浄し、95 °C で 5 分間煮沸しました。 サンプルは SDS-PAGE ゲルで泳動され、標準的なウェスタンブロット法によって PVDF 膜に転写されました。 膜をTBST中の5%無脂肪乳中でブロックし、一次抗体および二次抗体と連続してインキュベートしました。 一次抗体抗 SFPQ ウサギ モノクローナル抗体 (CST、#71992) を 5% 無脂肪乳の TBST 溶液で 1:1000 に希釈して使用し、4 °C で一晩インキュベートしました。 抗ウサギ IgG を 1:5000 で使用し、室温で 1 時間インキュベートしました。 膜は、Chemidoc MP イメージング システムによる化学発光を使用して視覚化されました。

溶媒アクセス可能表面積 (SASA) 解析に使用したすべての構造は、タンパク質データ バンク (PDB) 52 または AlphaFold タンパク質構造データベース 53 から取得しました。 各残基の絶対 SASA は、FreeSASA プログラム 54 を使用して計算されました。 各構造の平均 SASA を得るために、標識されたヒスチジンとその近傍の完全で明確な両方の SASA データのみが使用されました。 各ヒスチジンの相対溶媒接近性 (RSA) は、絶対 SASA 値を残基の経験的に考えられる最大溶媒接近表面積で割ることによって計算されました 55。 次に、平均 RSA が 20% 未満の場合はすべてのヒスチジンが埋没し、そうでない場合は露出していると分類されました 56。

DDA モードで取得した生ファイルは、Proteome Discoverer (v2.5) または MSfragger (Fragpipe v15.0) を使用して、一般的な汚染物質を含む対応する SwissProt レビュー済みタンパク質データベースに対して検索されました。 ペプチドは、固定修飾としてカルバミドメチル化、動的修飾としてメチオニン酸化という、最大 2 つの欠落切断部位を備えた完全なトリプシン処理である必要がありました。 前駆体およびフラグメントの質量許容差は、それぞれ 10 ppm および 0.02 Da (MS2 orbitrap) に設定されました。 汚染物質のヒットが除去され、タンパク質がフィルタリングされて、1% 未満の誤検出率が得られました。 3 つの生物学的複製からの正規化されたタンパク質存在量を、ラベルフリーの定量分析に使用しました。 タンパク質の細胞内局在解析は、DAVID Bioinformatics Resources の Gene Ontology (GO) 解析、MitoCarta 3.0、およびAlice Ting group によって収集および公開されたデータベースによって可能になりました8。 火山プロットは Perseus (v1.6.15.0) から取得されました。 タンパク質存在量の倍率変化は、両側 t 検定を使用して統計的有意性についてテストされ、ヒットタンパク質は存在量変化 >2 (特に明記しない限り) および p 値 <0.05 で特定されました。 タンパク質相互作用分析は、GO 分析と String データベースを使用して実行されました。

3 つの生物学的複製を実行すると、同様の結果が得られました。 統計分析は GraphPad Prism (GraphPad ソフトウェア) で実行され、火山プロットは Perseus (v1.6.15.0) から取得されました。 2 つのグループ間の比較のために、両側スチューデント t 検定を使用して p 値を決定しました。 実験グループで少なくとも 2 回のみ同定されたシングルトンタンパク質が火山プロットに含まれ、対照グループの対応する欠損値がペルセウスによって正規分布から置き換えられ、p 値の計算が可能になりました。 エラーバーは平均値 ± SD を表します。 プロテオミクス解析では、統計解析を可能にするために、少なくとも 2 つの生物学的複製に現れるタンパク質の存在量が保持されました。 サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されませんでした。 実験はランダム化されていませんでした。 研究者らは、実験と結果の評価中に割り当てについて知らされていませんでした。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究で生成された質量分析データは、データセット識別子 PXD034811 (PDPL-MS データセット) とともに iProX57 パートナー リポジトリを介して ProteomeXchange コンソーシアムに寄託されました。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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深セン湾研究所の質量分析コア施設、イメージングコア施設、シーケンシングコア施設のサンプル分析にご協力いただきましたことに感謝いたします。 有益な議論と校正の支援をしていただいた Yu-Hsan Tsai 博士、Xiaoyu Li 博士、Jeff Montgomery 博士に感謝します。 この研究に対する次の資金援助に感謝します: 国立自然科学財団からの助成金 (32101200 から GL)、広東・深セン地域共同基金からの助成金 (2020A1515110903 から GL)、および深セン湾研究所オープン基金からの助成金 ( SZBL2020090501008 から GL)。

Yansheng Zhai 氏、Xiaoyan Huang 氏も同様に貢献しました。

システム物理生物学研究所、深セン湾研究所、深セン、518132、中国

Yansheng Zhai、Xiaoyan Huang、Keren Zhang、Yuchen Huang、Jingwei Cui、Zhe Zhang、Weiye Zhong、Gang Li

化学科、UF Scripps Biomedical Research、130 Scripps Way、Jupiter、FL、33458、米国

ヤンロン・ジャン

中国科学技術大学生命科学部、合肥、安徽省、230026、中国

ヂェ・チャン

マルチオミクス質量分析コア、コア施設オフィス、深セン湾研究所、深セン、518132、中国

クックソン KC チウ

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著者全員が原稿をレビューしました。 GL がこの研究を考案し、研究を監督しました。 YZ、XH、KZ、YH、および GL が実験を設計および分析しました。 YZ、XH、KZ、YH、JC、WZ、CKCC が実験を行いました。 YJは化学メカニズムを提案しました。 ZZ は SASA 分析を実行しました。 YZとGLが原稿を書きました。

ガン・リーへの対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた他の匿名の査読者に感謝します。 査読レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Zhai、Y.、Huang、X.、Zhang、K. 他。 光活性化依存型近接標識による時空間分解タンパク質ネットワークプロファイリング。 Nat Commun 13、4906 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-32689-z

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受信日: 2022 年 3 月 23 日

受理日: 2022 年 8 月 11 日

公開日: 2022 年 8 月 20 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32689-z

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