真菌βの構造的および機構的洞察

Nature volume 616、pages 190–198 (2023)この記事を引用

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57 オルトメトリック

メトリクスの詳細

膜組み込みシンターゼ FKS は、真菌の細胞壁の中心成分である β-1,3-グルカンの生合成に関与しています 1,2。 FKS は、エキノカンジンやイブレキサフンガー p3,4 など、広く処方されている抗真菌薬の標的です。 残念なことに、FKS の作用機序は依然として謎に包まれており、このことが酵素を標的とするより効果的な医薬品の開発を妨げています。 ここでは、出芽酵母 FKS1 とエキノカンジン耐性変異体 FKS1(S643P) の低温電子顕微鏡構造を紹介します。 これらの構造は、膜と細胞質の境界面にある酵素の活性部位と、膜二重層にまたがるグルカンの移行経路を明らかにします。 FKS1 構造では複数の結合脂質と顕著な膜の歪みが観察され、FKS1 と膜の相互作用が活発に行われていることを示唆しています。 エキノカンジン耐性変異は、FKS1 の TM5 ～ 6 および TM8 付近の領域に集中しています。 FKS1(S643P) の構造は、この領域の脂質配置の変化を明らかにしており、変異型酵素の薬剤耐性機構を示唆しています。 この研究で明らかになったFKS1の構造、触媒機構、および薬剤耐性変異に関する分子的洞察は、真菌のβ-1,3-グルカン生合成の機構の理解を前進させ、FKSを標的とする新しい抗真菌薬を開発するための基盤を確立する。

侵襲性真菌感染症は年間 150 万人以上の死者を出しており、公衆衛生に重大な脅威を与えています5。 このような感染症は、免疫力が低下した人々や新型コロナウイルス感染症 (参考文献 5、6) の患者にとって重大な懸念事項です (たとえば、高い死亡率を引き起こします) (https://www.cdc.gov/fungal/covid-fungal.html) ）。 限られた種類の抗真菌薬や、最近の多剤耐性カンジダ・オーリスの発生などの新興薬剤耐性菌株は、感染患者の治療に深刻な課題を引き起こしています7,8。 したがって、新しい抗真菌剤の開発が急務となっています8。

β-1,3-グルカンは真菌細胞壁の基本的な構成要素であり 2、そのため、その生合成を標的とすることは、広域抗真菌薬を開発するための重要な戦略です 3,9。 真菌細胞壁のβ-1,3-グルカンは、GTPase Rho1 によって制御される膜組み込みシンターゼ FKS10,11 によって合成されます (参考文献 12,13)​​。 FKSは、β-1,3-グリコシド結合を介してドナーUDP-グルコースからグルカンの成長鎖にグルコースを移動させ、重合したβ-1,3-グルカンを細胞外空間に移動させます（図1a）。 FKS オーソログは、分析されたすべての真菌で同定されており、多くの著名な真菌病原体の生存に不可欠です。 Candida glabrata と S. cerevisiae では、FKS1 と FKS2 を同時に破壊すると致死的な表現型が示されました 14,15。 Candida albicans と Cryptococcus neoformans の FKS1 は生存能力に不可欠です 16,17。 FKS1 欠失を持つカビ Aspergillus humigatus は、重度の増殖欠陥と細胞溶解を起こします 18。 現在、FKS を標的とする 2 つのよく知られた抗真菌薬が市販されています。1 つは臨床現場で広く使用されている第一選択の抗真菌薬であるエキノカンジン 19、もう 1 つは新たに承認された経口殺菌薬 4 であるイブレキサファンガープです。 FKS 機能を標的とするさらに新しい薬剤 (レザファンギンなど) が後期臨床試験に入っています 4。 残念ながら、FKS 変異は、侵襲性真菌感染症における新たな懸念であるエキノカンジン耐性と治療失敗に密接に関連しています 20,21。 臨床的に同定された多数のエキノカンジン耐性変異は、FKS20、22 の 3 つの保存領域に集中しています。 単一の FKS 対立遺伝子の変異は、真菌株をエキノカンジンに対して耐性にするのに十分です 23。

a, 真菌の細胞壁のモデル。 FKS1 は UDP-Glc を使用して β-1,3-グルカンを合成します。 パネル a のグラフィックは、BioRender (https://biorender.com) を使用して作成されました。 b、FKS2阻害剤FK506の有無にかかわらず、WT株およびFKS1-KO（KO）株の増殖を調べることによるFKS1のインビボアッセイ。 データは平均値±標準誤差です。 n = 3 回の独立した実験。 c、さまざまなエフェクター：UDP-Glc、Rho1、GTPγS、および抗真菌薬（カスポファンギン（CFN）およびミカファンギン（MCF））を用いたCHAPS精製FKS1のインビトロ活性。 生成された UDP をモニタリングすることでアクティビティを測定しました。 データは平均値±標準誤差です。 n = 3 回の独立した実験。 d、e、GDN 精製 FKS1(S643P) によって合成された水不溶性ポリマーの酵素消化。 特定のエンド-1,3-β-グルカナーゼおよびエンド-1,4-β-グルカナーゼを使用しました。 これらの実験を 3 回繰り返しましたが、同様の結果が得られました。 ポリマー消化 (d) および指定された時間に採取され、薄層クロマトグラフィー分析に供された d の加水分解サンプル (e) の代表的な画像が示されています。 グルコース (G1)、ラミナリビオース (G2)、ラミナリトリオース (G3)、およびラミナリヘキサオース (G6) を標準として使用しました (レーン M)。 f、GDN 精製 FKS1(S643P) によって合成されたポリマーのグリコシル結合 (メチル化) 分析。 合成されたポリマーから誘導された部分的にメチル化された酢酸アルジトールのガスクロマトグラム プロファイルが示されています。 主要なピーク（緑色の点線のボックスで囲まれた）は 1,3-Glcp 結合を表しており、質量分析によって確認されています（拡張データ図 2d）。 g、FKS1 のドメイン構成の概略図。 h、膜と平行に見たFKS1のCryo-EMマップ。 マップは、g で色付けされているように 4 つの部分に分割されており、脂質のような密度は薄黄色で表示されています。 ｉ、漫画表示におけるＦＫＳ１構造の２つの直交する図。 FKS1 の 4 つの部分は g のように色付けされます。 j、TM ドメインが隠された細胞質領域の細胞内図。 FKS1 GT ドメインの中央の β シートは、標識されているように β3 ～ β11 で構成されています。 破線は無秩序な領域を示します。

FKS 構造の欠如は、FKS の触媒機構の理解を妨げ、新しい抗真菌薬の開発を妨げてきました。 FKS は、他の特徴づけられたグリコシルトランスフェラーゼ (GT) と低配列の相同性を持つ、約 200 kDa の膜に埋め込まれたタンパク質です。 FKS は GT48 ファミリーに属しており、どのメンバーにも利用できる構造はありません。 今回我々は、S. cerevisiae FKS1 とその薬剤耐性変異体 FKS1(S643P) の低温電子顕微鏡 (cryo-EM) 構造を報告します。 さらに構造に基づいた機能特性評価により、FKS1 による β-1,3-グルカン生合成の分子基盤を解明し、酵素の薬剤耐性変異を合理化することが可能になります。

in vivo 機能研究では、S. cerevisiae における FKS1 と FKS2 の両方の同時破壊によって引き起こされる致死表現型を回避するために、FKS1 の遺伝子欠失と FKS2 の薬理学的操作を組み合わせました 15。 野生型（WT）株は、FKS2特異的阻害剤FK506によりわずかに増殖が遅くなりました（参考文献15、24）（図1b）。 対照的に、FKS1 ノックアウト (KO) 株は、FK506 なしでは増殖の大幅な低下を示し、FK506 ではほぼ完全な増殖阻害を示しました。

次に、FKS1 活性アッセイに頻繁に使用される界面活性剤 CHAPS で内因的に発現した S. cerevisiae FKS1 を免疫精製しました 13,25 (「方法」を参照)。 伝統的に、FKS 活性は、粗膜または生成物が捕捉された FKS13、25、26 に対する放射性法によって測定されますが、今回我々は、生成された UDP をモニタリングすることで、FKS1 活性アッセイのための実用的な放射性標識を含まないシステムを構築できることを発見しました。 FKS1 単独では明らかな活性は示されませんでした。 GTPγS負荷型の精製Rho1を添加すると、FKS1の活性が劇的に上昇し（図1c）、FKS1に対するRho1の重要な調節役割が確認されました（参考文献12、13）。 WT FKS1 の比活性は約 824 nmol min-1 mg-1 と測定され、これは以前の研究と同等です 10、25、27。 さらに重要なことは、β-1,3-グルカン合成を阻害することができる 2 つの広く使用されている抗真菌薬であるカスポファンギンまたはミカファンギンの添加により、FKS1 活性が大幅に低下したことです。

β-1,3-グルカン合成におけるFKS1の役割をさらに確認するために、精製したFKS1によって形成された生成物を分析しました。 この目的のために、我々は WT FKS1 と、最も頻繁に観察されるエキノカンジン耐性変異の 1 つである変異体 FKS1(S643P) をテストしました 28。 我々は、後者の変異体がシンターゼの挙動を変える可能性があると仮説を立てました。 界面活性剤 GDN で均一になるまで精製すると (拡張データ図 1a-d および補足図 1)、WT FKS1 と FKS1(S643P) の両方が活性を示しましたが、これは免疫枯渇によって枯渇させることができます (拡張データ図 1h-j)。 我々は、GDN 精製 FKS1 がカスポファンギンによって活性化できることを発見しました。 カスポファンギンはFKS1(S643P)の活性を刺激することができます（拡張データ図1h–j）。 これは、カスポファンギンを含むFKS1(S643P)のみがかなりの量の水不溶性ポリマーを生成したスケールアップ生成物合成によってさらに確認されています(拡張データ図1k)。 GDN と CHAPS で精製された酵素の挙動が大きく異なるという事実 (拡張データ図 1i と図 1c) は、FKS1 機能が膜環境に敏感である可能性を示唆しています。 FKS1(S643P)による生成物合成は、UDP-GlcNAcよりも好ましいリガンドUDP-Glcに対するドナー特異性を示す(拡張データ図1l)。 さらに、EDTA は酵素の触媒活性をサポートすることができ、Mg2+ はその活性を有意に阻害しました (拡張データ図 1m)。これは以前の研究 25、29、30 と一致しています。 私たちの構造解析で発見された酵素不活化変異であるK1261A変異（「活性部位と触媒機構」のセクションを参照）をFKS1（S643P）に導入すると、高活性酵素の生成物合成活性が完全に不活性化されました（拡張データ図1h）。 -k)。 上記のアッセイは、FKS1 の特異的な酵素活性を示しています。

β-1,3-グリコシド結合の形成を確認するために、合成したポリマーに対してFKS1(S643P)による加水分解アッセイを実施しました。 その結果、エンド-1,3-β-グルカナーゼはポリマーを完全に加水分解できますが、エンド-1,4-β-グルカナーゼは加水分解できません（図1dおよび拡張データ図2a）。 薄層クロマトグラフィー分析により、合成ポリマーのエンド-1,3-β-グルカナーゼ触媒加水分解物がカードラン（β-1,3-グルカン標準）の加水分解物パターンと一致することが示されました（図1eおよび拡張データ図1e）。 2b、c)。 さらに、メチル化グリコシル結合分析により、1,3-Glcp が合成ポリマーの主要な結合であることが示されました (図 1f および拡張データ図 2d)。 要約すると、上記の生化学的研究と化学的研究を総合すると、FKS1 が β-1,3-グルカン シンターゼであることが確証されます。

FKS1のメカニズムをより深く理解するために、GDN精製FKS1のクライオEM構造を全体の解像度3.4Åで決定しました（図1g、h、拡張データ表1および拡張データ図3）。 密度マップにより、ほとんどの残基が解決された FKS1 の原子モデルを新規に構築することができました (拡張データ図 4)。 私たちの知る限り、これは GT48 ファミリーの膜結合 GT の最初の構造を表しています。

FKS1 の全体構造は約 100 Å × 115 Å × 100 Å です (図 1i)。 これには、17 の TM ヘリックス (TM1 ～ 17) を持つ膜貫通 (TM) ドメインと大きな細胞質実体が含まれています。 TM ドメインはくさび状の形状をしており、細胞外側にその狭い端部 (約 35 Å) があります。 FKS1 には明らかな細胞外構造ドメインがなく、いくつかの細長いループが TM ヘリックスを接続しています。 いくつかの非構造化領域があり、「方法」セクションの「モデルの構築と改良」で詳しく説明されています。

FKS1の細胞質部分には、一次配列のTM1-6によって分離されたN末端ドメインと中間ドメインが含まれています（図1g）。 中間ドメイン（残基712〜1266）は、GTのGT-Aフォールド特徴を採用しています。つまり、複数のαヘリックスに囲まれた9本の鎖（β3〜β11）の連続した中央βシートです31（図1jおよび拡張データ図3h）。 。 したがって、GT ドメインと呼ばれます。 N末端ドメイン（残基146〜442）には14個のαヘリックスが含まれています（ヘリックス6〜7は密度がないためモデル化されていません）（拡張データ図3i）。 Dali サーバーを使用した検索では、このドメインに類似した構造を取得できませんでした。 したがって、これをアクセサリ (AC) ドメインと名付けました。 AC ドメインは GT ドメインと広範囲に相互作用し、合計 2,504 Å2 の界面表面積を埋めています。 GTドメインからの3つのループ（β5とβ6（Lβ5–β6）、Lβ7–β8、およびLβ8–β9を接続するループ）は、ペンチのジョーのように機能してACドメインをクランプします（図1j）。 ACドメインの高度に保存されたR319は、ドメインインターフェースでGTドメインのN1087と相互作用します（拡張データ図3j）。 R319A 置換は FKS1 の機能を大幅に低下させることが以前に実証されており 24 、これは 2 つの細胞質ドメインがコンパクトな構造単位として一緒に機能することを示しています。

FKS1の合計17本のTMヘリックスのうち、TM1〜8は細胞質実体との相互作用インターフェースの大部分を提供します（図2a、bおよび拡張データ図3i）。 TM1〜4は密に詰まったらせん束を形成し、片側でTM5〜7と接触しています（図2c）。 TM5〜17は、サイトゾル側から見ると、開いた花びらのようにすべて傾いています（図2a、c）。 傾斜した TM5-17 と GT ドメインの間には、溶媒にさらされた大きなチャンバーがあり、酵素の活性部位の一部です (下記を参照)。 TM ドメインは 2 つの膜に埋め込まれたポケットを特徴としています (図 2a)。 細胞外側のポケットは、膜に露出した TM9-10 および TM12 が典型的な TM ヘリックスよりも大幅に短いために形成されます。 サイトゾル側のもう 1 つのポケットは、TM ヘリックスの傾斜により形成されます。 これら 2 つのポケットは、おそらく一緒になってグルカン転座の経路を形成します (以下を参照)。 さらに、5 つの長い細胞外ループ (EL1 ～ 5) が絡み合って、TM5 ～ 17 の近くの細胞外端を安定化します。 これらのループには、2つの保存されたジスルフィド結合（EL1のC658-C669およびEL2のC1328-C1345）と、保存されたN1849上の1つの潜在的なN結合型グリカンが見られます（図2a、b）。 TM5-17の傾斜により、細胞質末端の隣接するヘリックス間の距離が大きくなります（図2c）。 その結果生じた広範な空間は、膜二重層に平行な 3 つの側方ヘリックス (LH1 ～ 3) によって埋められます。LH1 ～ 2 は、2 つの 3 ヘリックス シート (TM11、TM12、および TM16、および TM14、TM15、および TM17) によって作成された大きなギャップを埋めます。 )、LH3 は LH1 ～ 2 の端をパディングします。

a、FKS1の正面図。 17 個の TM ヘリックス (数字で示されています) が漫画で示されています。 細胞質の AC ドメインと GT ドメインはそれぞれ黄色と青色のリボン内にあります。 EL1-2 の保存されたジスルフィド結合と EL5 の保存された N1849 の N-結合型グリカンが標識されています。 注文した脂質は黄色の棒です。 3 つの楕円は、触媒作用 (1 つの緑色のポケット) とグルカンの転座 (2 つの灰色のポケット) に関係する 3 つのポケットの位置を示しています。 b、FKS1 TM ドメインのトポロジー図。 破線は、マップ内では見えない柔軟な要素を示しています。 c、FKS1 TM ヘリックスのサイトゾルの図。 挿入図は、サイトゾル領域が非表示になっている場合と同じビューを示しています。 およその直径を持つ 2 つの円は、細胞質に向かって開いている TM5-17 の傾きを強調しています。 d. 内部リン脂質 (PL) と相互作用する残基 (棒として表示) は、a の実線のボックスで囲まれています。 e、aの破線のボックスで囲まれた脂質が豊富な領域の背面膜図。 f – i、FKS1（GT48ファミリー）（f）とGT2ファミリーの3つの膜結合シンターゼ：細菌セルロースシンターゼBcsA（タンパク質データバンク（PDB）ID：4hg6）（g）との間の推定共有フォールドの比較、植物セルロース合成酵素 CesA (PDB ID: 6wlb) (h) およびヒアルロン酸合成酵素 HAS (PDB ID: 7sp7) (i)。 重ね合わされた構造は漫画表現で個別に示されています。 それらの対応する要素は同じ配色ですが、共有フォールド外の要素はラベル付きの灰色の表面または漫画表現で表示されます。 f では、破線は無秩序な領域を示します。 j – m、FKS1 (j)、BcsA (k)、CesA (l)、および HAS (m) の TM 配置の比較。 灰色の影内の TM セグメントは共有フォールドに属します。 TM ヘリックスは番号で示されます。 アスタリスクは、FKS1、BcsA、CesA、および HAS で提案されているグルカン転座経路を示しています。

FKS1マップの解像度により、複数の規則的に結合した脂質を特定することができました（図2aおよび拡張データ図4g、h）。 細胞質膜リーフレットのリン脂質は、TM11、TM15〜16、およびLH2と接触します（図2d）。 その頭部基は、荷電残基 R1455 (TM11) および R1684 (TM16) と接触する準備ができています。 その 2 つの脂質アルキル尾部は、周囲の疎水性残基、H1654、I1655、および F1658 (TM15) で詰まっています。 I1680 (TM16); および V1745 および L1746 (LH2)。 LH1-2に加えて、このリン脂質もTMヘリックスの傾斜配置の安定化に寄与しているようです（図2a）。 他の脂質様密度は、主にTM5-13で構成されるコアの周囲に位置する24本の脂質アルキル鎖としてモデル化されました（図2c）。 これらのうち、7つの脂質はTM5〜6の周りを包み込み（図2c）、12つは傾斜したTMヘリックスによって作成された凹面を埋める2つの層を形成します（図2e）。 これらの明確に定義された脂質分子は、おそらく FKS1 の不可欠な構造の一部です。

FKS1 の構造は既知の構造を持つ膜結合型 GT とは根本的に異なりますが、FKS1 構造の一部 (残基 615 ～ 1510) が GT2 ファミリーの 2 つのセルロース シンターゼ、細菌 BcsA とその植物ホモログ CesA32,33 (図 2f–h)。 配列同一性が低い（10％未満）にもかかわらず、FKS1とBcsAは、308個の整列した残基にわたって4.3Åの二乗平均平方根偏差値で重ね合わせることができます（拡張データ図5a）。 DALI 相同構造検索により、このトポロジーに似た 2 つの追加構造、ヒアルロナンシンターゼ (HAS) とドリチルリン酸マンノーストランスフェラーゼ (PcManGT) が同定されました。 一貫して、HAS は BcsA34 と全体的な構造が類似していると報告されています (図 2i、m)。 PcManGT は、BcsA35 との最小限のセルロース合成酵素様フォールドを含むことが提案されています。 これらはさらに、これらの膜結合多糖シンターゼ (FKS1、BcsA、CesA、および HAS) が、セルロースシンターゼ様フォールドと呼ばれるコアフォールドを共有している可能性があることを示唆しています。 この折り畳みにはいくつかの特徴があります。6つのTMヘリックスで構成されており、GTドメインはN末端の2つのヘリックスをC末端の4つのヘリックスから分割しています（図2j–m）。 膜とサイトゾルの境界には、いくつかの両親媒性界面ヘリックス（IF）が含まれています（図2f-i）。 この境界付近では、GT ドメイン (FKS1 TM7、BcsA TM5、CesA TM3 および HAS TM3) に続く TM ヘリックスが伸長しており、グルカンの移行経路を裏打ちしていると提案されています 32,33,34。

このモジュール構造の折り畳みは全体的に類似しているにもかかわらず、かなりのFKS1特異的特徴が明らかになった(拡張データ図5)。 GTドメインはBcsAと比較して十分な拡張を獲得し（拡張データ図5a、b）、FKS1とBcsAの間のトポロジー的に対応するTMヘリックスは方向と長さが異なります（拡張データ図5c）。 さらに顕著な変化は、膜と細胞質の境界面にあります。 BcsA、CesA、および HAS は、3 つの類似した両親媒性 IF (IF1 ～ 3)33、34、36 を特徴としています (図 2g–i)。 FKS1では、IF3のトポロジカルな対応物は代わりにTMヘリックス（TM9〜10）になります（拡張データ図5d、e）。 IF1 ～ 2 は FKS1 に保存されますが、異なる状態を示します。 FKS1のIF1（つまり、GTドメインのヘリックスα33）はほぼ90°回転し、TM6とTM8の間に挟まれています（拡張データ図5d）。 BcsAのIF2はFKS1の残基1247〜1266に対応しており、ヘリックスとして予測されていますが、マップ内では不規則です（拡張データ図5c）。 この推定上のFKS1 IF2には、BcsA、CesAおよびHAS33、34、36の間で保存されている「QxxRW」モチーフが欠けていますが、後で説明するように、依然として触媒作用に寄与している可能性があります。

セルロース合成酵素様のフォールド内には、FKS1 の膜と細胞質の界面に溶媒にさらされた大きなチャンバーが含まれています（図 3a）。 このフォールドとBcsAのフォールドを並べると、FKS1のチャンバーがUDP結合BcsAの活性部位とよく重なっていることが明らかになり、チャンバーがFKS1の活性部位であることが強く示されています（図3b）。 DALI 検索により、FKS1 GT ドメイン (残基 718 ～ 1239) の相同構造: PcManGT、BcsA、GalNAc-T7、TarP、CesA、および HAS が検索されました。 また、カードラン合成酵素の AlphaFold モデルも分析しました。これは、カードラン合成酵素が FKS1 と同じポリマーを合成し、BcsA37 と高い相同性 (26% の同一性) を示すためです。 これらの標的の詳細な構造比較により、FKS1の活性部位がBcsA、CesA、カードランシンターゼ、HAS、PcManGTなどの膜結合酵素とよりよく重複することが明らかになりました（拡張データ図6）。 それらの生成物の立体化学は異なるにもかかわらず、活性部位の高い構造類似性は、BcsA、CesA、および HAS に関する以前の研究と一致して、これらのシンターゼの基質結合および触媒作用における同様の機構を示しています 33,34,36。 これらの洞察に基づいて、FKS1とBcsAの構造を重ね合わせ、それらの活性部位にある機能的に重要な共通の重要な残基を明らかにしました（図3c、d）。 たとえば、2 対の残基 (FKS1 の Y849 と E851、および K1082 と N1085、BcsA の Y149 と E151、および K226 と N229) および「ED モチーフ」(FKS1 の E1221 と D1222、および BcsA の E342 と D343) 2 つの酵素をうまく整列させることができます。 BcsA のこれらの残基は、ドナー結合 (BcsA の Y149 および E151、および K226 および N229) および一般的な触媒塩基アスパラギン酸塩 (ED モチーフ) の位置決めについて知られています 36。

a、膜と細胞質の境界面の活性部位を示すFKS1の断面図。 これは、グルカンの移行の可能性がある膜ポケットを接続します。 特定の構造要素は、図 2a のように色付けされた漫画表現で示されています。 TM ヘリックスは番号で示されます。 ヘリックスα35上に位置する高度に保存されたEDモチーフ(E1221およびD1222)は、マークされているように活性部位に面しています。 b、UDP結合BcsA（PDB ID: 4P00; 灰色、マゼンタ棒にUDP）とFKS1（オレンジ色）の間で共有されるセルロースシンターゼ様フォールドのGTドメインの重ね合わせ。 c、d、bの破線ボックスでマークされたBcsA（c）とFKS1（d）の間の活性部位の拡大図。 基質結合または触媒作用に関与する残基は棒として示されています。 c では、UDP がマゼンタの棒として示されています。 dでは、BcsAで保存されたFKS1残基が黄色の棒として強調表示されています。 e、FKS1の活性部位変異のインビボ機能アッセイ。 表示された菌株の 72 時間の増殖を、FKS2 特異的阻害剤 FK506 を使用しない場合 (左のランク) と使用する場合 (右のランク) でアッセイしました。 テストを 3 回繰り返しましたが、同様の結果が得られました。 f、示されたFKS1変異を有する株における細胞壁グルカンのレベル。 g、FKS1阻害剤CFNの有無にかかわらず、CHAPSで精製したWTおよび活性部位変異体のインビトロFKS1活性。 活性はタンパク質の量に対して正規化されました。 f、g の場合、データは平均値 ± 標準誤差です。 n = 3 回の独立した実験。

次に、3 つの異なるアッセイを使用して、これらの残基の機能的役割を検証しました。 まず、FKS1染色体座にそれらの変異を導入し、FK506の存在下で各変異株の増殖表現型をアッセイしました（図3e）。 Y849A;E851AおよびK1082A;N1085Aの二重変異、およびE851A、K1082AおよびD1222Aの単一変異はすべて、FKS1-KO株の程度まで株の増殖を妨げました（図3e）。 N1085A 変異は増殖を遅らせ、Y849A 変異は増殖に明らかな影響を与えませんでした。 次に、FK506 を使用せずに増殖させた場合のこれらの株の細胞壁グルカンのレベルを測定しました。 Y849A置換を除くFKS1-KO株を含むすべての変異は、WT株と比較してグルカンの全体的なレベルを減少させ（図3f）、それらの成長表現型とよく一致することを発見しました（図3e）。 最後に、我々はすべての単一FKS1変異体(FKS1(D1222A)を除く)を精製し、インビトロでの触媒活性を比較しました(図3gおよび拡張データ図1g)。 上記の細胞ベースの表現型と一致して、E851A、K1082A、および N1085A 変異は酵素活性を有意に低下させましたが、Y849A 変異は活性に軽度の影響を与えただけでした。 上記のインビボおよびインビトロ分析を総合すると、FKS1 活性部位およびその主要な構成残基の位置がしっかりと確立されます。

さらなる構造分析により、FKS1 触媒作用に重要な追加の残基を特定することができました。 BcsA の IF2 の「QxxRW」モチーフの R382 および W383 は、基質結合と触媒作用に重要であることが知られています 36。 このモチーフはFKS1では欠落していますが、BcsAのR382およびW383と同様に、K1261およびF1258はFKS1の対応する位置に位置しています（図3c、dおよび拡張データ図5e）。 セルロースシンターゼ様のフォールドを含む複数の膜結合シンターゼ (BcsA、CesA、および HAS) では、BcsA R382 に対応する正に荷電した残基がドナー結合に関与するのに対し、BcsA W383 に対応する芳香族残基はアクセプターを安定化するように機能します。 34,36 (拡張データ図 6)。 実際、F1258 と K1261 は両方とも、それらの単一アラニン変異の in vivo および in vitro 分析で実証されているように、FKS1 の機能に必須です（図 3e-g）。 上記の分析は、FKS1 と BcsA の間の中心となる触媒機構が保存されていることをさらに示唆しています。

FKS1 と BcsA はどちらも進行性多糖類合成酵素であり、その重合生成物であるグルカンは膜を越えて移動する必要があります 1,38。 これに応じて、FKS1は活性部位の直下に膜内にポケットが形成されています（図3a）。 TM5 ～ 8、TM11 ～ 12、および IF1 で囲まれています (図 4a)。 FKS1のTM5〜8およびTM11〜12はセルロース合成酵素様フォールドコアの一部であり、BcsA36のセルロース転座経路を形成するTM3〜8に対応します（図2j、k）。 このポケットの反対側の細胞外側には、界面活性剤密度がはるかに低い溶媒にさらされた別のポケットが存在し、これはEMマップから直接見ることができます（図4b）。 2 番目のポケットは、膜に露出した TM9 ～ 10 と TM12 が短いために形成されます。 膜面と並置された2つの親水性ポケットは、顕著な膜の薄化をもたらし（図4a、b）、これは、いくつかの膜トランスロカーゼについて提案されているように、膜を横切るグルカンの移行のエネルギー障壁を大幅に低下させる可能性があります39。 実際、FKS1のこの経路に沿った残基の変異により、FKS1の機能が変化しました（図4c、d）。 たとえば、2 つの保存された残基 (F1297 および H1298) は、活性部位とサイトゾル入口の間に位置します。 それらのアラニン置換はFKS1の機能を損ない、これはそれらがグルカンの誘導に関与している可能性を示唆している。 対照的に、細胞外出口を封鎖する2つの保存されたかさばる芳香族残基（F1311およびF1475）をアラニンで置換すると、変異株はWT株よりも速く増殖した。 我々はFKS1（F1475A）を精製することができ、in vitro触媒活性の増加とFKS1阻害剤カスポファンギンに対する感受性の低下を示し（図4d）、グルカン出口におけるF1475Aの拡大を示唆しました。

a、六角形の配列で示される、2 つの膜ポケットを通過する推定上のグルカン移動経路。 TM5-12 で囲まれた最初のポケット (内部の陰影付き表面ビュー) は、活性部位 (緑色の破線の楕円形) の下に位置します。 入口の誘導 (H1298 および F1297) と出口の封鎖 (F1311 および F1475) に関与する保存された残基が標識されています。 細胞外側では、膜に露出したTM9-10およびTM12が膜全体に広がるには短すぎる（28Å未満）ため、2番目のポケットが形成されます。 b、鮮明化されていない EM 密度マップは、グルカンの移行経路に近い界面活性剤の低下を示しています。 このパスは白い破線のボックスでマークされており、矢印は推定上の入口と出口を示しています。 洗剤の濃度は灰色で表示されます。 推定膜厚がラベル付けされます。 挿入図は、オレンジ色の線で囲まれた領域の細胞外の図を示しています。 c、グルカン移行経路の周囲に選択された変異を有するFKS1のインビボ機能アッセイ。 示された株の 48 時間の増殖を、FKS2 特異的阻害剤 FK506 を使用しない場合 (左) と使用する場合 (右) でアッセイしました。 d、FKS1阻害剤CFNの有無にかかわらず、CHAPSで精製したWTおよびF1475A変異体のインビトロFKS1活性。 活性はタンパク質の量に対して正規化されました。 データは平均値±標準誤差です。 n = 3 回の独立した実験。 e、FKS1(S643P) の構造は、産物の移動のための最初の膜ポケット (a に示す) 内の細長い密度 (青色のメッシュ) を示します。 この構造は、生成物を合成するための UDP-Glc の存在下で決定され、CFN によって促進されました。 TM ヘリックスは番号で示されます。 挿入図は、モデル化された 4-グルコースのグルカン鎖 (黄色の棒) とその対応する密度 (青色のメッシュ) を重ね合わせた拡大図を示しています。 f, グルカン相互作用に関与する可能性のある残基。

次に、基質結合または生成物結合を捕捉することを期待して、UDP-Glc およびカスポファンギンとインキュベートしたときの GDN 精製の高活性変異体 FKS1(S643P) の構造を 3.5 Å の分解能で決定しました (拡張データ図 7)。酵素の状態。 FKS1(S643P) の構造は、WT FKS1 の構造と大きな立体構造の違いを示していませんが (二乗平均平方根偏差約 0.7 Å)、我々は、その中の提案された産物転座チャネルに沿って伸長した密度に気づきました。これはおそらく境界に対応します。製品（図4e）。 4-グルコースのグルカン鎖をこの密度にモデル化しました（図4e、挿入図）。 FKS1の一連の親水性残基と疎水性残基は、酵素と生成物の相互作用を促進するためにモデル化されたグルカン鎖に沿って並んでいます（図4f）。 転座チャネルは細胞外側で閉じたままであり、HAS34について最近提案されているように、調節されたチャネル開口機構の存在を示唆している。

我々はまず、エキノカンジン耐性を分析するためのS. cerevisiaeベースのアッセイシステムを評価しました。 我々は、薬剤耐性 C. albicans で最も頻繁に観察される 2 つの変異 (CaFKS1 F641S および S645P)28 を選択し、それらを S. cerevisiae FKS1 の対応する部位 (ScFKS1 F639S および S643P) に導入しました。 両方の変異株は、カスポファンギンに対して非常に高い耐性を示しました（拡張データ図8a）。 これら 2 つの変異した ScFKS1 を CHAPS でさらに精製し、カスポファンギンによるそれらの阻害を評価しました（図 5a）。 対照としての WT ScFKS1 は典型的な阻害プロファイルを示し、IC50 は 0.55 μM と測定され、これは以前に異なる方法で測定されたものと同等でした 23,25。 対照的に、ScFKS1(F639S) と ScFKS1(S643P) は両方ともカスポファンギンによる阻害に対して非感受性です。

a、WT FKS1および最も頻繁に観察される2つのエキノカンジン耐性変異：F639SおよびS643Pを含む、CHAPSで精製されたFKS1変異体のCFN阻害プロファイル。 残存活性のパーセンテージが表示されます。 データは平均値±標準誤差です。 n = 3 回の独立した実験。 b. エキノカンジン耐性変異を持つ 3 つのホットスポット領域 (赤色、HS1 ～ 3 と表示) が FKS1 構造上にマッピングされています。 ホットスポット領域は、それぞれ TM5、TM8、TM6 の 3 つの隣接する TM ヘリックスのクラスター上に局在しています。 FKS1 内の保存されたセルロース合成酵素様の折り畳みは漫画表示で強調表示され、残りの部分はリボン表示で表示されます。 この保存された折り目は、黄色の棒で示される規則正しい脂質によって囲まれています。 破線は無秩序な領域を示します。 c、bで概説したエキノカンジン耐性変異の拡大図。 これらのホットスポット領域の外側にあるイブレキサフンガープ耐性変異部位 (A1369) も示されています。 突然変異の Cα 原子は赤い球として示されています。 ホットスポット領域には規則正しい脂質が豊富に含まれており、選択された脂質密度が灰色のメッシュで表示されます。 d、薬剤耐性変異であるFKS1(S643P)の導入によるHS1領域周辺の構造変化と脂質配置(赤い矢印で示す)。 これは、FKS1 構造 (灰色) と FKS1(S643P) 構造 (青色) の重ね合わせで示されています。 黒い破線は、潜在的な極性相互作用を示します。

次に、FKS1 構造を使用して、エキノカンジン耐性の考えられる機構的基盤を調査しました。 エキノカンジン耐性変異は、その位置に応じて、TM5 (ホットスポット 1) の残基 639 ～ 647、TM8 (ホットスポット 2) の残基 1354 ～ 1357、および TM6 (ホットスポット 3) の残基 690 ～ 700 を含む 3 つの保存領域に分類されました (残基はScFKS1)20、22、40のように番号が付けられています(補足図2)。 一次配列では分離されていますが、3 つの変異ホットスポットは空間的に互いに近接しています (図 5b、c)。 イブレキサフンガープに耐性のある C. glabrata 分離株では、FKS2 ホットスポット 1 および 2 の外側に新たな変異部位が報告されました (たとえば、CgFKS2 W715L および A1390D) 41。 これらの変異部位は、ScFKS1のホットスポット3のW695およびホットスポット3に隣接するTM8のA1369にそれぞれ対応します（図5c）。 この分析は、エキノカンジンとイブレキサフンガーp41の間のFKS結合部位が重複していることを示唆しています。 これらの薬剤耐性ホットスポット領域は膜環境と密接に関係しているようです。 FKS1のすべてのエキノカンジン耐性変異は、TM5〜6およびTM8によって形成された凸状の疎水性表面の近くにマッピングされており、特にいくつかの規則正しい脂質分子によって囲まれています（図2cおよび5c）。 ホットスポット 1 領域の F639 と S643 は脂質結合に関与しています。 F639の側鎖は3つの脂質分子と直接相互作用し、S643側鎖は脂質相互作用残基Y638の主鎖を固定しているようです（図5d）。 さらに、変異によって誘発される脂質結合の変化に焦点を当てて、FKS1（S643P）の構造を分析しました（拡張データ図7）（図5d）。 濃縮脂質付近のいくつかのホットスポット 1 残基は、立体構造の変化を示しています。 Y638 のサイドチェーンは約 90°回転し、F639 のサイドチェーンも同じ方向に回転します。 注目すべきことに、これらの変化は近くの結合脂質の変化につながり、脂質環境の変化がS643P変異の結果生じたものであることを示唆している。

我々の結果に基づいて、FKS1 の 2 つの薬剤耐性メカニズムの可能性を提案します。 まず、エキノカンジン型薬剤は異なる構成の脂質尾部を持つリポペプチドであるため19（拡張データ図8b、c）、エキノカンジン耐性変異のクラスターパターンはこれらの薬剤の結合部位の可能性を示唆しており、その結合には脂質が関与している可能性があります。尾部（図5b、c）。 したがって、薬物耐性は、突然変異に起因する薬物結合部位の変化に起因すると考えられる。 第二に、薬剤耐性ホットスポット領域近くの濃縮された秩序脂質とFKS1（S643P）の構造から明らかになった脂質の動きを考慮すると（図5c、d）、薬剤耐性変異によりFKS1の応答が変化する可能性があると考えられます。エキノカンジンによる膜変化。 このような機構は、同じくリポペプチド薬であり膜に作用する抗生物質であるダプトマイシンおよびポリミキシンについて提案されている 42,43。 一貫して、特定の膜マイクロドメインが β-1,3-グルカンの合成に関連していることが報告されています 44,45。 さらに、脂質微小環境の変化は、FKS に対するエキノカンジンの作用と相関することが実証されています46、47。

私たちの研究により、真菌のグルカン合成酵素 FKS1 の分子構造が明らかになりました。 FKS1 の構造は、広範な機能特性とともに、真菌細胞壁の β-1,3-グルカン合成の機構的理解を前進させます。 エキノカンジン耐性変異の構造に基づく解析と S643P 変異体の構造は、FKS1 変異の薬剤耐性メカニズムの妥当性を示唆しています。 これらの洞察は、FKS オルソログが高度に保存されているため、さまざまな真菌病原体によっても共有される可能性があります (拡張データ図 9 および補足図 2)。 今回の研究で解明されたFKS1の構造と触媒機構は、この重要な抗真菌薬標的の将来の研究や、新しい抗真菌薬のスクリーニングや開発の枠組みとして役立つ可能性がある。

3x Flag タグは、PCR ベースのタグ付け法を使用して、S. cerevisiae BY4742 株の染色体 FKS1 の C 末端に操作されました 48。 FKS1(S643P)染色体変異を有する酵母株は、相同組換え法を用いて作製された49。 クライオ EM 分析および生成物合成のために、FKS1 および FKS1(S643P) 変異体を以下に記載するように界面活性剤 GDN で精製しました。 株をYPD培地中で30℃で20時間培養した。 細胞を遠心分離によって収集し、1 mM フェニルメタンスルホニルフルオリド (PMSF) を補充した 50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl および 2 mM MgCl2 を含む溶解バッファー中でフレンチ プレスによって溶解しました。 溶解物を15,000gで30分間遠心分離しました。 上清を100,000gで1時間超遠心分離しました。 回収した膜ペレットを緩衝液 50 mM Tris-HCl pH 7.4、500 mM NaCl、2 mM MgCl2、10% (v/v) グリセロール、1.5% (w/v) n-ドデシル-β-d-マルトピラノシド ( DDM; Anatrace）、0.15% コレステリルヘミサクシネート トリス塩（CHS; Anatrace）およびプロテアーゼ阻害剤（cOmplete プロテアーゼ阻害剤カクテル; Roche）を 2 時間穏やかに撹拌します。 15,000gで0.5時間遠心分離することによって上清を回収し、Anti-Flag M2アフィニティーゲル(Sigma)に適用した。 次いで、ゲルを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ ２ および０．０４％ ＧＤＮ（Ａｎａｔｒａｃｅ）を含有する洗浄緩衝液で洗浄した。 標的タンパク質を、150μg ml-1の3×Flagペプチドを補充した洗浄緩衝液で溶出した。 溶出液を濃縮し、50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、2 mM MgCl2および0.04% GDN (Anatrace)を含む緩衝液を用いたサイズ排除クロマトグラフィー(Superose 6 10/300 GL カラム、GE Healthcare)を使用してさらに精製した。 単分散ピークの中心画分を収集し、クライオ EM グリッドの調製と生成物合成のために濃縮しました。

N末端6×His-SUMOタグ付きS.セレビシエRho1のベクター構築物を大腸菌BL21(DE3)に形質転換した。 株を、OD600が約0.6に達するまで、100μg ml-1のアンピシリンを補充したLB培地中で37℃で培養した。 タンパク質発現は、0.5 mM イソプロピル-β-d-1-チオガラクトピラノシドを用いて 18 °C で 20 時間誘導されました。 収集した細菌を再懸濁し、50mM Tris-HCl pH 7.4、300mM NaClおよび2mM MgCl2を含む緩衝液A中でフレンチプレスにより溶解した。 遠心分離後、ニッケル-ニトリロ三酢酸 (Ni-NTA) アフィニティークロマトグラフィーを使用してタンパク質を上清から精製しました。 緩衝液Aに透析する際、6×Hisタグ付きプロテアーゼUlp1を1:200のUlp1:Rho1(w/w)比で添加して、6×His-SUMOタグを除去した。 切断された 6x His-SUMO タグとプロテアーゼは、再度 Ni-NTA アフィニティークロマトグラフィーを実行して除去され、フロースルーを収集、濃縮して、 50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、および 2 mM MgCl2。 15.6 mlの単分散ピークの中央画分を収集し、10 mg ml-1まで濃縮した。

単一粒子クライオ EM 分析では、5 mg ml-1 の濃度の精製 FKS1 の 3 μl アリコートをグロー放電 Quantifoil カーボン グリッド (R1.2/1.3 Au、300 メッシュ) に適用しました。 グリッドは湿度 100% で 4 秒間ブロッティングされ、FEI Vitrobot IV を使用して液体エタン中で急速冷凍されました。 UDP-Glc でインキュベートした FKS1(S643P) サンプルの場合、GDN (7 mg ml-1) で精製した FKS1(S643P) を、0.7 mg ml-1 Rho1、10 μM GTPγS を添加した UDP-Glc (0.5 mM) と混合しました。 、２００μＭカスポファンギン、０．１％ＣＨＡＰＳおよび０．０２％ＣＨＳ。 混合物を 16 °C で 2 時間インキュベートした後、クライオ EM グリッドを凍結しました。 クライオ EM データは、GIF 量子エネルギー フィルターの後に配置された Gatan K3 Summit カメラを備えた 300 kV で動作する FEI Titan Krios 電子顕微鏡で収集されました。 自動データ収集は SerialEM または FEI EPU を使用して実行されました。 顕微鏡写真は、超解像度計数モード、公称倍率×130,000、物理ピクセルサイズ1ピクセルあたり0.92Åで記録されました。 デフォーカス値は -1.2 μm から -3 μm の範囲でした。 1.3 秒の合計露光は 32 フレームに線量分割され、合計累積線量は Å2 あたり 50 e- となりました。

記録された線量分割されたムービーは、最初に MotionCor2 を使用して位置合わせされ、線量加重が行われました (参考文献 50)。 次に、CTFFIND4 を使用して、個々の顕微鏡写真のコントラスト伝達関数パラメータを決定しました 51。 手動検査によって明らかになった低品質の顕微鏡写真は、さらなる分析から除外されました。 後続の画像処理ステップは、RELION-3 (参考文献 52) を使用して実行されました。

FKS1 データセットの場合、2,000 個の粒子のセットが手動で選択され、参照ベースの自動粒子ピッキング用の 2D クラス テンプレートが生成されました。 自動ピッキングにより、11,606 枚の顕微鏡写真から 2,321,905 個の粒子が得られました。 低品質の粒子を除去するためにリファレンスフリーの 2D 分類を 2 回実行し、1,335,014 個のクリーンな粒子セットが得られました。 ab initio マップは RELION で生成され、さらなる 3D 分類のための初期参照モデルとして使用されました。 3 ラウンドの 3D 分類の後、高解像度の特徴 (267,574 個の粒子) を持つ 3D クラスが選択されました。 その後の粒子研磨、3D リファインメント、および後処理により、全体の解像度が 3.4 Å のマップが生成されました。

FKS1(S643P) データセットの場合、約 2,000 個の粒子のセットが手動で選択され、参照ベースの自動粒子ピッキング用の 2D クラス テンプレートが生成されました。 自動ピッキングにより、9,623 枚の顕微鏡写真から 2,222,315 個の粒子が得られました。 低品質の粒子を除去するためにリファレンスフリーの 2D 分類を 2 回実行し、1,620,308 個の粒子のクリーンなセットが得られました。 FKS1 モデルは、さらなる 3D 分類のための初期参照モデルとして使用されました。 高解像度の特徴 (690,251 粒子) を備えた 3D クラスが選択されました。 その後の粒子研磨、3D リファインメント、および後処理により、全体の解像度が 3.6 Å のマップが生成されました。 この再構成により、産物移行チャネル内のフラグメント密度が明らかになり、結合産物の有無にかかわらず混合状態が示されました。 したがって、TM7-12 および転座チャネルを囲む活性部位の周囲に集中マスクを使用して、粒子の再調整を行わずに集中 3D 分類の追加ラウンドを実行しました。 最高解像度の機能 (176,682 粒子) を持つ 3D クラスが選択されました。 選択された粒子は、フルマスクによる 3D 精製とその後の後処理のために再抽出されました。 これにより、全体の解像度が 3.5 Å のマップが生成され、FKS1(S643P) モデルの構築に使用されました。

全体的な解像度は、ゴールドスタンダードのフーリエシェル相関 0.143 基準に基づいて推定されました53。 局所解像度分布は ResMap54 を使用して推定されました。

FKS1 の大まかな初期モデルは、PHENIX55 の map_to_model モジュールを使用して新たに生成されました。 Coot56 を使用した手動調整と再構築によってさらに改善されました。これは、TM ヘリックス周囲の良好な密度と、Trp、Tyr、Phe、Arg などの残基周囲の嵩高い密度によって促進されました。 実空間のクライオ EM マップに対する FKS1 モデルの改良は、PHENIX で二次構造と幾何学的拘束を使用して実行されました 55。 最終的な FKS1 モデルには、N 末端 145 残基、C 末端 16 残基、細胞質ドメインの 6 つの柔軟なセグメント (残基 244 ～ 278、475 ～ 487、798 ～ 805、897 ～ 931、1159) を含むいくつかの非構造化領域があります。 -1167 および 1247-1266)、および TM ヘリックスを接続する 4 つのループ セグメント (残基 1419-1435、1516-1554、1627-1637、および 1698-1723)。 FKS1(S643P)のモデルはFKS1のモデルをベースに作られています。 MOLPROBITY を使用して最終モデルを評価しました57。 モデルとマップ間のフーリエ シェル相関は、PHENIX.mtriage58 によって計算されました。 相同構造検索はDALIサーバー59を用いて実施した。 FKS1 との構造比較のために、カードランシンターゼの AlphaFold モデル構造を使用しました 60,61。 図示された図は、PyMOL (Schrödinger, LLC)、Chimera および ChimeraX62,63 を使用して作成されました。 3D 再構成とモデルの改良の統計を拡張データ表 1 に示します。

FKS1 染色体変異を有する酵母株および FKS1-KO 株は、相同組換え法を用いて作製されました49。 変異体はSD-His（ヒスチジンを含まない酵母合成ドロップアウト培地、カタログ番号S0020、Solarbio）で選択され、ゲノムPCRおよびDNA配列決定によって確認されました。 増殖表現型の分析のために、変異株のスポット増殖アッセイは以前に記載された方法 24 から適応されました。 株をYPD培地中、30℃、200rpmでOD600が0.8になるまで対数増殖期まで培養した。 細胞をOD600が0.1になるまで希釈した。 次いで、示された菌株の10倍希釈液の5μl部分を、FK506(1μg ml-1)の存在下または非存在下でSD-His上にスポットした。 30 °C で指定された時間インキュベートした後、プレートを 5200CE Image System (TANON) で写真撮影しました。 各アッセイを 3 回繰り返しましたが、同様の結果が得られました。

細胞増殖のプロファイリングを行うために、WT 株と FKS1-KO 株を YPD 培地中で 30 °C で一晩増殖させて対数期まで増殖させました。 次いで、培養細胞を、1μg ml-1 FK506を添加または添加せずに、初期OD600が0.01の新鮮なYPD培地に接種した。 次に、新しい培養物を定常期まで 30 °C で増殖させました。 培養中、光学密度 (OD600) を 8 時間間隔で 48 時間測定しました。 細胞増殖曲線を作成するために実験を 3 回繰り返しました。

Ｃ末端３×Ｆｌａｇタグを有する異なるＦＫＳ１変異体を有する酵母菌株を、上記のように生成し、培養し、溶解した。 回収した膜を、50 mM Tris-HCl pH 7.4、1 mM EDTA、33% グリセロール、0.5% CHAPS (Anatrace)、0.1% CHS (Anatrace)、4 μM GTPγS およびプロテアーゼ阻害剤 (cOmplete プロテアーゼ阻害剤カクテル、ロシュ）。 FKS1およびその変異体は、抗Flag M2アフィニティーゲル(Sigma)を使用して精製し、50 mM Tris-HCl pH 7.4、1 mM EDTA、33%グリセロール、0.2% CHAPSおよび0.04% CHSを含有し、150μgを添加した緩衝液で溶出した。 ml−1 3× Flag ペプチド。 界面活性剤CHAPSまたはGDNで精製したタンパク質を、UDP-Glo​​グリコシルトランスフェラーゼアッセイキット(Promega)を使用してアッセイし、放出されたUDPをモニタリングした。 FKS バリアントのうち、2.5 μl を、50 mM Tris-HCl pH 7.4、33% グリセロール、1 mM EDTA、6 μg ml-1 Rho1、0.2% CHAPS、0.04% CHS、4 μM GTPγS を含む合計 30 μl の反応混合物に添加しました。および 20 mM フッ化カリウム (KF)。 UDP-Glcを最終濃度2.5mMまで添加することにより反応を開始した。 反応を30℃で1時間実施した。 発光は、Pherastar FS システム (BMG Labtech) を使用して記録しました。 最終活性は、DYKDDDDKタグモノクローナル抗体(1:1,000希釈、カタログ番号66008-3-Ig、クローン番号2B3C4、Proteintech)を使用して、3×Flagタグに対するイムノブロッティングによって測定したFKS1量に対して正規化しました。 阻害剤プロファイリングの場合、反応する他の成分を添加する前に、エキノカンジン薬剤の段階希釈物を最初に室温で 10 分間 FKS1 変異体とインキュベートしました。

in vitro β-1,3-グルカン合成では、界面活性剤 GDN (FKS1 または FKS1(S643P) 変異体; 0.02 mg ml-1) で精製した酵素とドナー UDP-Glc (2.5 mM) を反応バッファー (50 mM) で混合しました。 mM Tris-HCl pH 7.4、33% グリセロール、1 mM EDTA、6 μg ml-1 Rho1、0.2% CHAPS、0.04% CHS、4 μM GTPγS および 20 mM KF）、200 μM カスポファンギンの存在下または非存在下。 反応容量は、100 μl (アニリンブルー染色の場合) または 10 ml (生成物の濃縮とその後の酵素分解およびグリコシル結合分析の場合) に設定されました。 反応は 30 °C で指定された時間実行されました。

アニリンブルーによる合成産物の染色のために、反応物質または0.1% (w/v)のS. cerevisiae β-グルカン(Sigma)の100μlアリコートを採取し、等量のアニリンブルー(0.03%; Sigma)に添加した。 ）。 色素を完全に結合させるために、混合物を暗所で 20 分間インキュベートしました。 次に、各サンプルをキャピラリーにロードし、励起波長 365 nm および発光波長 433 nm の蛍光顕微鏡で観察しました。 各アッセイを 3 回繰り返しましたが、同様の結果が得られました。

インビトロで合成されたポリマーは水不溶性であり、遠心分離によって収集されました。 それを緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、３３％グリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％ ＣＨＡＰＳ、０．０４％ ＣＨＳ、２０ｍＭ ＫＦで２回洗浄し、脱イオン水で２回洗浄した。 合成したポリマーの分解分析には、エンド-β-1,3-グルカナーゼ (Trichoderma sp.; 製品コード: E-LAMSE、Megazyme) またはエンド-β-1,4-グルカナーゼ (Aspergillus niger;品番：イーセラン、メガザイム）。 これら 2 つの酵素を最初に緩衝液 (100 mM NaAc pH 4.5) 中で透析しました。 次いで、各酵素０．５Ｕを、２００ｍＭ ＮａＡｃ（ｐＨ４．５）中の１％（ｗ／ｖ）合成ポリマー５０μｌに添加した。 標準対照セルロース (C6288、Sigma) またはカードラン (C7821、Sigma) の分解も同じ条件で実行されました 64,65。 混合物を40℃でインキュベートし、さまざまな時間間隔でサンプルを取り出し、反応を停止させるために5分間煮沸しました。 次いで、酵素分解生成物を薄層クロマトグラフィーによって分析した。 簡単に説明すると、採取したサンプルの 2 μl アリコートをシリカゲル プレート (Merck シリカゲル 60 F254) 上にスポットし、n-ブタノール:酢酸:水 (2:1:1 v/v/) を含む溶媒系で展開しました。 v)。 プレートをメタノール:硫酸 (95:5 v/v) に浸漬し、その後 95 °C で加熱することによって視覚化しました。 グルコース (G5767、Sigma)、ラミナリビオース (O-LAM2、Megazyme)、ラミナリトリオース (O-LAM3、Megazyme) およびラミナリヘキサオース (O-LAM6、Megazyme) の混合物を薄層クロマトグラフィー標準として使用しました。

合成ポリマーの酵素消化中に、放出された還元糖を DNS 試薬 (Micro Reducing Sugar Assay Kit、Abbkine) を使用して測定しました。 簡単に言うと、175μlの希釈加水分解サンプルを125μlのDNS試薬と混合した。 標準曲線の作成には、濃度範囲 0.2 ～ 0.6 mg ml-1 のキットの標準を使用しました。 反応混合物を水浴中で５分間沸騰させた。 氷水浴中で室温まで冷却した後、0.2 mlのサンプルの吸光度を540 nmで測定した。

FKS1によってインビトロ合成されたポリマーを緩衝液：50mM Tris-HCl pH 7.4、33%グリセロール、1mM EDTA、0.2% CHAPS、0.04% CHS、20mM KFで2回洗浄し、脱イオン水で2回洗浄した。 次いで、洗浄したサンプルを脱イオン水中で透析し、凍結乾燥した。 以前の研究66に従ってメチル化分析を実施しました。 乾燥サンプル(約1mg)をDMSO(500μl)に溶解した。 メチル化はDMSO/NaOH中でヨードメタンを用いて1時間実施した。 メチル化生成物を 2 M トリフルオロ酢酸で 121 °C で 90 分間加水分解し、NaBD4 で還元し、無水酢酸で 100 °C で 2.5 時間アセチル化しました。 得られた部分メチル化アルジトールアセテートを、Agilent BPX70 クロマトグラフィー カラム (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm、SGE) を備えた GC-MS システム (6890A-5975C、Agilent Technology) を使用して分析しました。 温度プログラムは次のように設定しました: 140 °C で 2 分間、140 ～ 230 °C で 3 °C/分、および 230 °C で 3 分間。

β-1,3-グルカンのレベルは、以前に記載されているように、アニリンブルーアッセイを使用して測定されました23、26、67、68、69、70、71、72。 試験株をYPD培地中でOD600が0.5になるまで対数増殖期まで増殖させた。 各菌株について同量の細胞を5,000gでの遠心分離によって収集した。 回収した細胞をＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で２回洗浄した。 ペレット化した細胞を０．５ｍｌのＴＥ緩衝液で懸濁し、０．１ｍｌの６Ｍ ＮａＯＨと混合した。 混合物を 80 °C の水浴中で 30 分間インキュベートして、グルカンを可溶化しました。 次いで、２．１ｍｌのアニリンブルー（０．０３％アニリンブルー、０．１８Ｍ ＨＣｌおよび０．４９Ｍグリシン－ＮａＯＨ、ｐＨ９．５）を各サンプルに添加した。 サンプルを簡単にボルテックスし、50 °C で 30 分間インキュベートし、さらに 24 °C で 30 分間インキュベートしました。 蛍光は、蛍光プレートリーダー（CLARIOstar Plus、BMG Labtech）を使用して、励起波長400 nmおよび発光波長460 nm（カットオフ455 nm）下で定量した。 すべてのサンプルを 3 回繰り返して測定しました。

タンパク質サンプルは SDS-PAGE ゲルで分離され、クーマシーで染色されました。 ゲルバンドを手動で切除し、脱色した。 タンパク質は DTT で還元され、IAA でアルキル化され、20 mM 重炭酸アンモニウム中のプロテオミクスグレードのトリプシンで消化されました 73。 消化は 37 °C で一晩実行され、2% ギ酸を添加することで停止されました。 ゲル中のペプチドは、2% ギ酸および 67% アセトニトリルを含む溶液を使用して抽出されました。 ペプチドを真空乾燥し、0.1% ギ酸に再懸濁し、トラップカラム nanoViper C18 (3 μm、100 Å) にロードし、分析カラム (Acclaim PepMap RSLC、75 μm × 25 cm、C18 2 μm、100 Å) で分離しました。 Å) EASY nLC 1200 HPLC システム (Thermo Fisher) を使用します。 溶出勾配は、30 分間で 5 ～ 38% のバッファー A (0.1% ギ酸および 80% アセトニトリル) でした。 質量分析は、Q Exactive 質量分析計 (Thermo Fisher) で実行されました。 結果として得られたデータは、ProteoWizard で mgf ファイルに変換され、UniProt Saccharomyces cerevisiae データベースに対して誤検出率 1% 未満でタンパク質を同定するために Mascot 検索エンジンを使用して分析されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

EM 密度マップは、アクセッション コード EMD-33154 (FKS1) および EMD-34115 (FKS1(S643P)) として電子顕微鏡データ バンクに寄託されています。 座標は、アクセッション コード 7XE4 (FKS1) および 7YUY (FKS1(S643P)) で PDB に登録されています。 この研究では、アクセッション コード 4HG6、6WLB、7SP7、6YV8、6iwr、6h4m、および 1qgq で PDB から公開されているいくつかのタンパク質構造を分析しました。

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データ収集にご協力いただいた南方科学技術大学クライオEMセンターのスタッフ全員に感謝いたします。 薄層クロマトグラフィーについてアドバイスを求めた J. Zhao。 この研究は、中国国家自然科学財団（HY への 92053112 および 31971148、Min Zhang への 32100575 および Mingjie Zhang への 82188101）、深セン人材プログラム KQTD20210811090115021（Mingjie Zhang および XL へ）、中央大学の基礎研究基金によって支援されました。 (HY への 5003510056 および Min Zhang への 5003510112) および HUST アカデミック フロンティア ユース チームのプログラム (HY への 2018QYTD02)。

これらの著者は同様に貢献しました: Xinlin Hu、Ping Yang

中国・武漢の華中科学技術大学同済医科大学基礎医学部生化学・分子生物学科

Xinlin Hu、Ping Yang、Changdong Chai、Jia Liu、Huanhuan Sun、Yanan Wu、Min Zhang、Hongjun Yu

中国武漢の華中科学技術大学同済医科大学基礎医学部病原体生物学科

Xinlin Hu、Jia Liu、Min Zhang

南方科技大学生命科学部、深セン、中国

張明傑 & 劉暁天

グレーターベイ生物医学イノセンター、深セン湾研究所、深セン、中国

チャン・ミンジエ

中国、武漢の華中科技大学、細胞アーキテクチャ研究センター

ユ・ホンジュン

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XH、PY、Min Zhang、XL、HY はサンプルを準備し、データを収集し、構造を解明しました。 XH、PY、Min Zhang は、CC、JL、HS、YW の支援を受けて機能実験を実行しました。Mingjie Zhang、Min Zhang、XL、HY が実験を設計し、データを分析し、原稿を執筆しました。

Min Zhang、Xiaotian Liu、Hongjun Yu との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた Vincent Bulone と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a、洗剤GDNで精製したFKS1のゲル濾過クロマトグラフィー(Superose 6 Increase 10/300 GL)の溶出プロファイル。 緑色の破線のボックスは、cryoEM 分析用にプールされた画分をマークします。 b、(a) の単分散溶出ピークの画分の SDS-PAGE (左) およびウェスタンブロット (右) 分析。 3つの複製のうちの代表的なゲルおよびウェスタンブロットの画像が示されています。 c、洗剤GDNで精製したFKS1 S643のゲル濾過クロマトグラフィー(Superose 6 Increase 10/300 GL)の溶出プロファイル。 緑色の破線のボックスは、cryoEM 分析および生成物合成のためにプールされた画分をマークします。 d、(c) の単分散溶出ピークの画分の SDS-PAGE 分析。 3 つの複製のうちの代表的なゲルを示します。 e、Rho1のゲル濾過クロマトグラフィー(Superdex 200 Increase 10/300 GL)の溶出プロファイル。 緑色の破線のボックスは、活性アッセイおよび生成物合成のためにプールされた画分をマークします。 f、(e)の単分散溶出ピークの画分のSDS-PAGE分析。 (e) の 2 つのピークは同様の 3 バンド パターン (f) を示し、3 つのバンドすべてが質量分析により Rho1 として同定されました。 3 つの複製のうちの代表的なゲルを示します。 g、界面活性剤CHAPSで精製された野生型FKS1およびさまざまなFKS1変異体のウェスタンブロット分析。 3 つの複製のうちの代表的な画像を示します。 h、GDN精製したflagタグ付きFKS1変異体のSDS-PAGE分析。活性(ij)および生成物合成(k)のアッセイに使用した。 最初のレーン、FKS1 WT。 2 番目のレーン、FKS1 S643P (エキノカンジン耐性変異体)。 3 番目のレーン、精製 FKS1 S643P は抗フラグ ビーズによって免疫除去されています。 4番目のレーン、FKS1 S643P/K1261A。 3 つの複製のうちの代表的なゲルを示します。 （b、d、f、g、h）については、その完全なスキャンが補足図1に提供されています。i、GDNで精製されたFKS1変異体のインビトロ活性。 生成されたUDPをモニタリングすることによって活性をアッセイした(1時間の反応)。 データは平均値 ± SEM、n = 3 回の独立した実験です。 j–k、GDN で精製された FKS1 変異体による In vitro 生成物合成アッセイ。 アッセイは、合成産物を染料アニリンブルーで染色することによって（j; 12時間の反応）、または合成産物を視覚化することによって（k; 48時間の反応）によって実行されました。 これらの実験を 3 回繰り返しましたが、同様の結果が得られました。 Ｉ、ＧＤＮ精製ＦＫＳ１ Ｓ６４３Ｐによる生成物合成のドナー特異性。 水不溶性ポリマー（白い矢印で示す）は、UDP-GlcNAc ではなく UDP-Glc が存在する場合にのみ現れます。 この実験を 3 回繰り返しましたが、同様の結果が得られました。 m、GDN 精製 FKS1 S643P の触媒活性に対する Mg2+ の影響。 活性は、1 mM EDTA または 200 μM Mg2+ の存在下でアッセイされました。 データは平均値 ± SEM、n = 3 回の独立した実験です。 挿入図、1 mM EDTA または 200 μM Mg2+ の存在下での生成物の合成。 この実験を 3 回繰り返しましたが、同様の結果が得られました。

a、GDN 精製 FKS1 S643P によって合成された水不溶性ポリマーの酵素消化中に放出された還元糖の定量。 2 つの特定のグルカナーゼ、つまり特定のエンド-1,3-β-グルカナーゼとエンド-1,4-β-グルカナーゼが使用されました。 データは平均値 ± SEM、n = 3 回の独立した実験です。 b-c、エンド-1,3-β-グルカナーゼおよびエンド-1,4-β-グルカナーゼの加水分解特異性を、標準多糖類β-1,3-グルカン カードラン (b) およびセルロース (c) に対してテストしました。 グルコース (G1)、ラミナリビオース (G2)、ラミナリトリオース (G3)、およびラミナリヘキサオース (G6) の混合物を標準として使用しました (レーン M)。 d、（図1f）のGCピーク（11.64分）の質量スペクトルは、このPMAAが1,3,5-トリ-O-アセチル-2,4,6-トリ-O-メチルグルシトールであることを明らかにし、これを確認します1,3-Glcp結合。

a、11606 枚の収集した顕微鏡写真からの FKS1 の代表的なクライオ EM 顕微鏡写真。 b、代表的な 2D クラスの平均。 c、FKS1のクライオEMデータ取得とデータ処理のフローチャート。 詳細については、「メソッド」を参照してください。 d, 再構成されたマップのゴールドスタンダード フーリエ シェル相関 (FSC) 曲線。 e, モデルとマップ間の FSC 曲線。PHENIX.mtriage58 によって計算されます。 f、最終的な 3D 再構成で使用されるすべての粒子の角度分布の断面図。 g、ResMap54 で計算された、FKS1 の最終クライオ EM マップの局所解像度分布。 h、FKS1 GT ドメインのトポロジー図。 3D 再構成では見えない柔軟なセグメントは破線で示されています。 i. AC ドメインと GT ドメイン間の相互作用。 中央のβ鎖と広範な接触界面に関与する構造要素が標識されています：ACドメインのα2-5、α8-11、ループLα9-α10およびLα11-α12。 α31、α34-35、ループLβ5-β6、Lβ7-β8; GT ドメインの Lβ8-β9)。 FKS1 R319 は、以前に同定された FKS124 の必須残基であり、その Cα 原子によって球体としてマークされ、この界面に埋め込まれています。 j、(i) のボックス領域を拡大表示し、AC ドメインと GT ドメイン間の界面を維持するための R319 と N1087 間の相互作用を示しています。

a、TM1-8、11-17のクライオEM密度。 bc、FKS1 GT ドメインに特徴的な 9 ストランドの連続中央βシートの Cryo-EM 密度。 d、N1849 上の N-グリカンの Cryo-EM 密度。 e, 活性部位の Cryo-EM 密度。 f、TM9 および TM10 付近のクライオ EM 密度の断面図。 マップは図 2a のようにセグメント化され、色付けされます。 TM ヘリックス TM7 ～ 12、TM14 ～ 16 に対応する密度は数字で示されています。 このマップからは TM9-10 主鎖のみを追跡できますが、それらは他の TM ヘリックスよりも弱い密度を示します。 g–h、結合脂質を含む FKS1 モデルの 2 つのビュー。 FKS1モデルは図1hのように色付けされており、秩序ある脂質は黄色の球として示されています。 脂質のクライオ EM 密度は破線のボックスに示されています。 膜貫通ドメイン内に埋め込まれたリン脂質の位置と密度を実線のボックスに示します。

a, FKS1 の保存されたフォールド (残基 615 ～ 1510) は、BcsA (PDB ID: 4P00; 残基 63 ～ 584) の保存フォールドと重ねられ、308 の整列した残基にわたる RMSD 値は 4.3 Å でした。 BcsA は灰色で表示されます。 FKS1 コアはオレンジ色で色付けされており、GT ドメイン内の FKS1 専用エレメントは (a) および (b) のラベルのように色分けして表示されます。 対応する TM ヘリックスはラベルとして示されていますが、TM9 および TM10 は FKS1 専用です。 b、(a) で重ね合わされた GT ドメインの拡大図。 GT ドメインに特徴的な中央の β シートは、FKS1 で拡張されます。 FKS1の伸長スタンドβ6およびβ7と伸長ループLβ8-β9は、FKS1のACドメインとの相互作用インターフェースの実質的な部分に寄与しています（図1j）。 さらに、2 つの FKS1 特異的サブ領域が、中央の β シートの最初の鎖である β3 の両側に挿入されます。 β3 に先行するサブ領域 (残基 719 ～ 840) には 6 つのヘリックスと 1 対の逆平行 β ストランド (β1、β2) が含まれています。 β3 に続くサブ領域 (残基 848 ～ 998) は 9 つのヘリックスで構成される α ヘリックスです。 これら 2 つのサブ領域は相互作用して、中央の β シートを片側から詰め込みます。 c、重ねられた膜貫通ドメインの背面図。 d、重ね合わされた膜-サイトゾル界面の拡大図。 界面ヘリックス IF1 は FKS1 に保存されており、BcsA と比較して劇的な再配置が示されています。 βシートと膜貫通ドメインをつなぐ界面ヘリックスIF2はFKS1では保存されているが、構造は乱れており、これも(c)に示されている。 FKS1 では界面ヘリックス IF3 が失われ、FKS1 では膜貫通ヘリックス TM9 および TM10 に置き換えられています。 e、FKS1とBcsAの間の保存されたセルロースシンターゼ様フォールドの構造に基づく配列アラインメント。 アライメントは最初に PROMALS3D を使用して生成され、次に ESript3 サーバーを使用して図示されました。 重要な機能を持つ残基とモチーフが標識されています。 アラインメントの上下には、それぞれ FKS1 構造 (青色の記号) と BcsA 構造 (PDB ID: 4P00) (オレンジ色の記号) に由来する二次構造要素が示されています。 記号は、TM ヘリックス (黒のバー)、ヘリックス (白のバー)、および β ストランド (矢印) です。

分析された GT 触媒ドメインは重ねて漫画として個別に表示されます。 基質結合または触媒作用に関与する残基は棒として示されています。 結合したヌクレオチドは、薄いマゼンタの棒として示されています。 細菌セルロース合成酵素 BcsA の活性部位 (a) を参照として使用すると、保存された残基が黄色で強調表示されます。 a-f、膜結合型グリコシルトランスフェラーゼの GT 触媒ドメインのオーバーレイ: 細菌性セルロース合成酵素 BcsA (a; PDB ID: 4hg6)、β-1,3-グルカン合成酵素 FKS1 (b)、植物セルロース合成酵素 CesA (c; PDB ID) : 6wlb)、ウイルス ヒアルロナン シンターゼ (d; PDB ID: 7sp7)、アグロバクテリウム カードラン シンターゼ (e; AlphaFold データベースからのモデル; Uniprot ID: Q9X2V0)、古細菌マンノシルトランスフェラーゼ PcManGT (f; PDB ID: 6YV8)。 青いボックス（a〜e）で囲まれたパネルは、図2f〜mに示すセルロースシンターゼ様の折り畳みを含む膜結合多糖シンターゼです。 PcManGT (パネル f) には BcsA の半膜トンネルが含まれており、最小のセルロース合成酵素様フォールドを持つことが提案されています 35。 g-i、可溶性グリコシルトランスフェラーゼの GT 触媒ドメインのオーバーレイ: ヒト GalNAc-T7 (g; PDB ID: 6iwr)、黄色ブドウ球菌 TarP (h; PDB ID: 6h4m)、B. subtilis SpsA (i; PDB ID: 1qgq) ）。

a、9623 枚の収集した顕微鏡写真からの FKS1 S643P の代表的なクライオ EM 顕微鏡写真。 b、代表的な 2D クラスの平均。 c、FKS1 S643PのクライオEMデータ取得とデータ処理のフローチャート。 詳細については、「メソッド」を参照してください。 d, 再構成されたマップのゴールドスタンダード フーリエ シェル相関 (FSC) 曲線。 e, モデルとマップ間の FSC 曲線。PHENIX.mtriage58 によって計算されます。 f、最終的な 3D 再構成で使用されるすべての粒子の角度分布の断面図。 g、ResMapで計算されたFKS1 S643Pの最終クライオEMマップの局所解像度分布。 h、サンプル領域における FKS1 S643P モデルを使用したクライオ EM マップの適合。

a、FKS1 変異が示された S. cerevisiae 株のカスポファンギン耐性表現型の分析。 試験されたカスポファンギンの濃度が上部に示されています。 b、4 種類のエキノカンジン薬剤の化学構造。 ボックスで強調表示されているように、それらはすべて脂質テールを特徴としています。 c、FKS1構造から同定された脂質アルキル鎖（左パネル）およびリン脂質（右パネル）の化学構造。

a〜c、FKS1 構造は配列保存のレベルに応じて色分けされています (赤、高、青、低)。 a-b、漫画表示での膜に平行な背面図と正面図。 c、(b) と同じ図であり、表面表現が含まれています。

このファイルには、切り取られていないブロット (補足図 1) と、さまざまな病原性真菌および出芽酵母からの FKS オルソログの多重配列アラインメント (補足図 2) が含まれています。

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転載と許可

Hu, X.、Yang, P.、Chai, C. 他真菌のβ-1,3-グルカン合成酵素FKS1の構造的および機構的洞察。 Nature 616、190–198 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41586-023-05856-5

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受信日: 2022 年 3 月 29 日

受理日: 2023 年 2 月 16 日

公開日: 2023 年 3 月 22 日

発行日: 2023 年 4 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05856-5

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