HDAC6 の薬理学的阻害はジストロフィンの筋肉表現型を改善します

Nature Communications volume 13、記事番号: 7108 (2022) この記事を引用

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デュシェンヌ型筋ジストロフィーではジストロフィンが存在しないため、ジストロフィン関連糖タンパク質複合体が破壊され、その結果、線維化、微小管および神経筋接合部の組織破壊に関連する骨格筋線維の脆弱性および萎縮が引き起こされます。特異的な非従来型の細胞質ヒストン脱アセチル化酵素 6 (HDAC6) が、アセチルコリン受容体の分布と筋萎縮を調節することが最近示されました。今回我々は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのmdxマウスモデルにHDAC6選択的阻害剤ツバスタチンAを投与すると、筋力が増加し、微小管、神経筋接合部、ジストロフィン関連糖タンパク質複合体の組織が改善され、筋萎縮と線維化が軽減されることを報告する。興味深いことに、我々は、HDAC6 阻害の有益な効果には、トランスフォーミング成長因子ベータシグナル伝達の下方制御が関与していることを発見しました。 HDAC6 阻害は、細胞質内の Smad3 アセチル化を増加させることにより、Smad2/3 のリン酸化、核移行、および転写活性を低下させます。これらの発見は、Smad3がHDAC6の新たな標的であるという生体内証拠を提供し、HDAC6がデュシェンヌ型筋ジストロフィーの潜在的な治療標的であることを示唆している。

デュシェンヌ型筋ジストロフィー (DMD) は、世界中の新生児男性の約 3,500 人に 1 人が罹患している X 連鎖神経筋劣性疾患であり、筋ジストロフィーの最も一般的かつ致死的な形態です 1,2。 DMD 患者は 3 ～ 4 歳で最初の臨床症状が現れ、7 ～ 13 歳で車椅子に依存するようになります。ステロイド治療を早期に開始することで、多くの DMD 男児の歩行期間を延長することができます。この病気の末期段階は、患者が 20 歳までに補助換気を必要とするときに始まり、通常、患者は 30 歳代または 40 歳代で呼吸不全または心不全により死亡します 3、4、5、6、7。 DMD は、非機能的なジストロフィンの合成またはその完全な欠如を引き起こすジストロフィン遺伝子の変異によって生じます。ジストロフィンは、筋肉のジストロフィン関連糖タンパク質複合体 (DGC) の重要な構成要素です8。 DGC は筋鞘にまたがる構造で、ジストロフィンとアクチンおよび微小管細胞骨格の両方との結合、および基底層のラミニンへのジストグリカンの結合を介して、内部細胞骨格と細胞外マトリックスの間に機械的結合を形成します 9,10。筋肉の収縮中、DGC は分子ショックアブソーバーとして機能し、細胞膜を安定させます 11,12。ジストロフィンの損失は DGC の損失と関連しており、筋肉の劣化と変性が起こり、それによって DGC がその機能を発揮できなくなります。これにより、筋線維が収縮による膜損傷を受けやすくなり、細胞死につながります13、14、15、16。この病理学的プロセスには炎症と線維症が伴い、筋肉の消耗と機能喪失に関与します17、18、19、20、21。

多大な研究努力にもかかわらず、DMD患者に対する治療法はまだありません。 DMD を治療するために、エクソンスキッピング、終止コドンの抑制、アデノ随伴ウイルス (AAV) 媒介ミニジストロフィン送達、または CRISPR/Cas9 遺伝子編集などの遺伝子ベースの治療戦略が積極的に研究されています 22,23。並行して、薬物療法も開発されています24、25、26、27。このようなアプローチは、ユートロフィン A28、29、30 の上方制御を引き起こす可能性のあるものを含む、特定のシグナル伝達経路および細胞事象に作用します。それにもかかわらず、糖質コルチコイドは依然としてゴールドスタンダード療法として機能し、主に抗炎症薬として作用します31。ステロイドと集学的ケア、特に人工呼吸器の使用により、DMD 患者の平均余命は大幅に延長され、現在では罹患者の年齢は 30 ～ 40 歳に達することもあります。

TGF-β シグナル伝達は、神経筋障害における筋萎縮および線維化の促進において中心的な役割を果たします。 GDF8/ミオスタチン、GDF11、アクチビンなどのさまざまなリガンドが II 型 TGF-β 受容体に結合し、活性化時に Smad2 および Smad3 転写因子のリン酸化を引き起こします。 Smad2/3 リン酸化により、Smad4 とのオリゴマー化と核への移行が可能になり、FoxO 転写因子と連携して筋萎縮に関与する遺伝子の発現が活性化されます 32,33,34。 Smad2 と Smad3 の阻害は筋肉の成長を誘導するのに十分であり、Smad3 の構成的発現は筋肉消耗を引き起こします 35,36。興味深いことに、以前の研究では、TGF-β と mTOR シグナル伝達の間にクロストークが存在することが示されています。実際、ミオスタチン/GDF8 は、Smad3 による PTEN 翻訳の増加を介して Akt/mTOR シグナル伝達を阻害します 37。総合すると、TGF-β シグナル伝達は筋萎縮を防ぐための魅力的な薬理学的標的であるようです。このような薬物ベースの治療は、いくつかの神経筋疾患、悪液質、サルコペニアなどの萎縮性疾患に大きな効果をもたらす可能性があります。

HDAC6 は、クラス IIb HDAC に属するヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) ファミリーの固有の細胞質メンバーです 38,39。 HDAC6 は、α-チューブリン、コルタクチン、HSP90 などのいくつかの細胞質基質を脱アセチル化しますが、他の HDAC は通常、遺伝子発現の中心的な制御因子です。実際、HDAC4 や HDAC5 などの古典的な HDAC は、ミオゲニンや Foxo3 転写因子を介したアトロジーンの制御に関与しています 40,41。これに関連して、我々は以前、HDAC6がFoxO3aによって活性化され、ユビキチンリガーゼatrogin1/MAFbx42と相互作用できるアトロジーンであることを示した。さまざまな疾患を治療するために、特定の HDAC6 阻害剤を開発するために多大な努力が払われてきました。特に、HDAC6 を標的とするいくつかの抗がん治療が提案されています 43,44。さらに、HDAC6 の欠失または阻害は、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) やシャルコー・マリー・トゥース病などの一部の神経変性疾患に有益であることが示されています 45,46,47。 HDAC 阻害剤であるツバスタチン A (TubA) は、選択性の高い HDAC6 阻害剤として際立っています。実際、TubA は、15 nM の IC50 と、HDAC8 (57 倍) を除く他のすべての HDAC (1000 倍以上) よりも HDAC6 に対する厳密な選択性で、HDAC6 デアセチラーゼ活性を効率的かつ特異的に阻害します 46、48、49。 TubA は肺線維芽細胞における TGF-β 誘導性 1 型コラーゲン発現を阻害することが知られており 50,51、以前の報告では TGF-β が HDAC の活性を増加させることが示されています 650,52。実際、Smad7 は TGF-β53 に応答して前立腺がんにおける HDAC6 の発現を調節しており、HDAC6 はマウスにおけるラパマイシンの機械的標的 (mTOR) シグナル伝達を介して原始卵胞の維持と活性化のバランスをとる上で不可欠な役割を果たしている可能性があります 54,55。

汎 HDAC 阻害剤を用いた以前の研究では、HDAC 阻害がジストロフィー表現型を改善することが示されています 27,56。ただし、どの HDAC がこの有益な効果に関与しているのかは、現時点では不明のままです。最近の研究で、我々は、HDAC6 が微小管の安定性と正常な筋線維におけるアセチルコリン受容体 (AChR) のクラスター化を調節していることを発見しました 57。したがって、我々は、HDAC6 が DMD の病態メカニズムにおいて役割を果たし、この疾患の新規治療標的として使用できるのではないかと考えました。これをテストするために、DMD mdx マウスモデルと C2C12 細胞における HDAC6 の高選択的阻害剤である TubA の効果を調査しました。まとめると、我々の結果は、TubA による HDAC6 デアセチラーゼ活性の薬理学的阻害が、mdx マウスの筋肉に機能的および形態学的両方で有益であることを示しています。 TubA の作用機序の機構研究により、HDAC6 阻害が骨格筋における Smad3 アセチル化の増加を通じて TGF-β シグナル伝達を下方制御することが明らかになりました。

ジストロフィン欠損マウスにおける HDAC6 デアセチラーゼ活性の阻害の効果を評価するために、7 週齢の mdx マウスに 25 mg/kg の用量で TubA (mdx-TubA) またはビヒクル (mdx-veh) を毎日腹腔内注射しました。 /日は前述したとおりです46,58。マウスは 30 日間治療され、mdx マウスでのこの治療期間を使用した以前の前臨床研究との比較が可能になりました 59、60、61。未処理の野生型対照マウス（WT-CTL）マウスをベースライン対照として使用しました（図1a）。 TubA による治療の効率は、まずチューブリンのアセチル化の増加を測定することによって評価されました (図 1b)。図1c、1dに示すように、連続30日間のTubA処理により、予想通り、mdxマウスの前脛骨筋（TA）におけるα-チューブリンのアセチル化が大幅に増加しました。公開データ 57,58 と一致して、アセチル化チューブリンの相対レベルの定量化は、選択的 HDAC6 阻害剤による治療後に約 36.5% ± 7.8% の増加を示しました (mdx-veh マウスと比較して P < 0.001)。 HDAC6 阻害がヒストンアセチル化に影響を及ぼさないことを確認するために、TA 筋におけるヒストン H3 のリジン 9 (ac-H3K9) アセチル化と総ヒストン H3 レベルをウェスタンブロットによって評価しました。 mdx マウスの進行中の筋肉損傷と一致して、H3K9 アセチル化は、WT-CTL 動物と比較して mdx マウスの TA 筋肉で増加しました（+43.8％±14.6％;補足図1a、b）。 HDAC6タンパク質レベルは、WT-CTL筋肉と比較してmdxマウス筋肉で増加しました（+97％±18.7％;補足図1c、d）。しかし、TubA は mdx マウスにおいて H3K9 アセチル化も HDAC6 レベルも増加させませんでした (P > 0.05)。まとめると、これらのデータは、TubA の腹腔内注射が筋肉における HDAC6 デアセチラーゼ活性を効率的かつ特異的に阻害することを示しています。

TubA 治療のプロトコル。 3 つの生後 7 週齢マウスのグループを、治療なし (グループ A、C57BL/10 マウス: WT-CTL)、または DMSO を 30 日間連続して毎日注射して治療した (グループ B、C57BL/10ScSn) のいずれかで 4 週間評価しました。 -Dmdmdx/J マウス; mdx-veh)、または 25 mg/kg/日の TubA を併用 (グループ C、C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J マウス; mdx-TubA)。 b TA 筋肉におけるチューブリンのアセチル化 (ac-tubK40) のレベルを評価するために、ウェスタンブロット分析を実行しました。アセチル化α-チューブリン（c）およびα-チューブリン（α-tub、d）タンパク質レベルの定量（グループあたりn = 4〜5匹のマウス）は、それぞれα-チューブリンおよび2,2,2-トリクロロエタノール（TCE）に対して正規化されました。。 e 握力は、体重で正規化された最大後肢握力を測定するグリッド上で測定されました（グループあたり n = 5 マウス）。 f 相対的な力の増加は、最終日（30日目）と治療開始前日（0日目）に測定され、対応のあるt検定で測定された握力の差によって計算されました（グループあたりn = 5マウス）。 g 比最大力は、30日目に各動物で得られた握力の最良スコアによって評価した(1群あたりn = 5匹のマウス)。 TA 筋におけるユートロフィン A (Utr. A) および β-ジストグリカン (β-DG) のレベルを評価するために、ウェスタンブロット分析 (h、k) および定量化 (i、l) を実行しました (グループあたり n = 4 マウス)。 TCEをローディングコントロールとして使用しました。 EDL 筋肉の断面を、ユートロフィン A (j、灰色) または β-ジストログリカン (m、灰色) に対する抗体で染色しました。スケールバー: 50 μm。異なるHDAC6阻害剤TubA（5μM）およびtubacin（TBC、5μM）またはDMSO（CTL）で24時間前処理した4日齢のC2C12筋管。 o ユートロフィン A を示す代表的なウェスタンブロット。GAPDH をローディングコントロールとして使用しました。 p GAPDHで正規化したユートロフィンAタンパク質レベルの定量化(n = 3の独立した実験を定量化)。 (c、d、e、f、g、i、l、p) ひげの最小値から最大値まで。ボックスの中央の線は中央値でプロットされます。 *P < 0.05; **P < 0.01; ns、有意ではない、P > 0.05; マン・ホイットニーの U 検定。 kDa、キロダルトン単位の相対分子量。

次に、mdx マウスの筋力に対する TubA 治療の効果を評価しました。 7週齢の未処理mdxマウスは、WT-CTLマウスと比較して、すべての足で有意に低い握力を示しました（ P < 0.01）（図1e）。 TubAによる30日間の治療後、mdxマウスの握力は1.5倍に有意に増加し（mdx-vehマウスと比較して P < 0.05;図1e）、30日にわたって実質的な力の増加が見られました（ P <0.05;図1e）。 .1f）。 TubA処理により、mdxマウスの筋力はWTレベルまでほぼ完全に回復しました（WT-CTLマウスと比較して P = 0.5476;図1e）。興味深いことに、最大力も、個体間変動のため有意水準には達しませんでしたが、TubA処理mdxマウスではmdx-veh動物と比較して35％±9.0％増加しました（ P = 0.062;図1g）。筋肉の疲労しやすさを評価するために、30 日間の TubA 治療後に、15 秒間隔で一連の 8 回の連続握力テストを実施しました。ビヒクルで治療された mdx マウスは、疲労を示す進行性の体力の低下を示しました。 TubAによる治療は、この握力の低下を効果的に防止し、ビヒクルで治療したmdxマウスと比較して、高さ引っ張り時の握力が24.5％±6.4％増加しました（P <0.05;補足図1e）。まとめると、これらのデータは、mdx マウスにおける HDAC6 デアセチラーゼ活性の阻害により、筋力と疲労感が WT レベルに回復することを示しています。

ユートロフィン A はジストロフィンと機能的および構造的に類似しているため、DMD におけるジストロフィンの欠如を補うことができます 24、29、62、63。成人および健康な筋線維では、ユートロフィン A はもっぱら筋腱接合部とシナプスに局在しており 64,65、筋線維全体に沿ったユートロフィン A の発現がジストロフィンの欠乏を効果的に補うことができることが現在十分に確立されています 24,29,66,67,68。 Mdx マウスは、DMD 患者よりも全体的に穏やかな表現型を示します 69。これは、筋鞘ユートロフィン A 発現の代償性アップレギュレーションによって部分的に説明されます 24、25、29、62、63、70、71。したがって、図1aに記載されているすべての動物グループの筋肉をウェスタンブロットと免疫蛍光によって分析し、ユートロフィンAのレベルを評価しました。予想どおり、ユートロフィンAレベルはmdxの筋鞘で増加しました（P <0.05、図1h）。 WT-CTLマウスと比較したマウス。 TubA処理により、mdx-vehマウスと比較してユートロフィンAレベルが約2倍さらに増加しました（P < 0.05;図1i）。免疫蛍光実験により、TubA処理が実際にmdxマウス筋肉の筋鞘ユートロフィンAレベルの増加を引き起こし、それによって筋線維の完全性に対してより高い保護効果を与える可能性があることがさらに確立されました（図1j）。さらに、TubA 治療が筋鞘に沿った DGC の再構築を引き起こすかどうかを判断するために、DGC のメンバーである β-ジストログリカン (β-DG) の量と局在の両方を評価しました。予想通り、ジストロフィンが存在しない場合、細胞膜でのβ-DG蓄積は大幅に減少します（図1k、m）。ウェスタンブロット定量化により、TubAがmdxマウスにおけるβ-DGの量を43.2%±7.0%増加させることが明らかになった(P<0.05;図11)。 TubAを用いた免疫蛍光実験（図1m）は、ユートロフィンAレベルの増加に加えて、細胞膜でのβ-DG蓄積が増加したことを示し、TubA処理がDGC複合体の再構築を促進したことを示唆しました。

DGC発現に対するTubAの効果が培養筋細胞でも観察されたかどうかを確認するために、C2C12筋管を、HDAC6デアセチラーゼ活性の2つの選択的阻害剤のうちの1つ5μM、TubAおよびtubacin72（TBC;図1n）で24時間処理しました。処理後、ユートロフィン A 発現をウエスタンブロットにより全細胞抽出物で評価しました (図 1o)。両方のHDAC6阻害剤は、ビヒクル処理細胞と比較して、C2C12筋細胞においてユートロフィンAレベルの約1.75倍（P<0.05）の有意な上方制御を誘導した（図1p）。これらのデータを総合すると、HDAC6 阻害剤による治療により C2C12 筋管内のユートロフィン A レベルが増加することが実証され、mdx マウスで in vivo で得られたデータと一致します。

TubA 治療が mdx 筋線維にさらなる利益をもたらすかどうかを判断するために、筋萎縮を評価しました。これまでの組織病理学的研究では、非常に小さな線維の大幅な増加を伴う異常な線維サイズ分布が筋ジストロフィーの特徴であることが示されています73。したがって、線維サイズ分布は、TubA またはビヒクルで処理された mdx マウスの遅酸化ヒラメ筋 (SOL) および速解解糖性の長趾伸筋 (EDL) の個々の線維の断面積 (CSA) を測定することによって評価されました。コントロールマウス。予想どおり、ビヒクルで処理した mdx 筋肉の CSA プロファイルは、健康な筋肉と比較すると、かなりの不均一性を示し、小さな線維が多くありました (図 2a、b)。分析されたすべての筋肉において、TubAは、小さな筋線維の割合を大幅に減少させ、大きな筋線維の割合を減らすことにより、線維サイズ分布をWT筋肉のそれに匹敵するレベルに回復しました（図2c、d）。 TubA で治療した mdx マウスでは、これらの筋肉の適応には平均分散係数の大幅な減少が伴いました。実際、TubA治療は、mdx EDLおよびSOL筋肉における線維CSAの分散係数を〜25％（mdx-vehマウスと比較して P <0.01）減少させました（図2e、f）。全体として、TubA による 30 日間の治療により、EDL 筋と SOL mdx 筋の両方の線維サイズ分布が正規化され、筋萎縮および変性に対する TubA の保護効果が示されました。

ビヒクル-DMSO（mdx）で処理した11週齢のC57BL/10マウス（WT-CTL）およびC57BL/10ScSn-Dmdmdx/JマウスのEDL（a）およびSOL（b）筋肉全体の断面積（CSA） -veh）またはTubA（mdx-TubA）で30日間連続してラミニン染色を使用して染色し、次にImageJで二値化しました（グループあたりn = 5マウス）。スケールバー: 500 μm。 EDL (c) および SOL (d) 筋肉における CSA のグラフ概要 (各グループあたり n = 5 匹のマウス。マウスごとに EDL および SOL 筋肉全体をカウント)。 c、d データは平均値±SEMとして表示されます。 *P < 0.05; **P < 0.01; 二元配置分散分析 (mdx-TubA 対 mdx-veh)。各筋肉の CSA 中央値が頻度ヒストグラムの上に表示されます。 EDL (e) および SOL (f) 筋線維の分散係数の測定 (グループあたり n = 5 マウス)。 TA 筋肉における MAFbx (g、h) および MuRF1 (i、j) のレベルを評価するために、ウェスタンブロット分析 (g、i) および定量化 (h、j) を実行しました (グループあたり n = 5 マウス)。 k EDL および SOL 筋肉の断面の代表的な例は、ヘマトキシリンおよびエオシンを使用して染色されました。スケールバー: 100 μm。中心に核のある繊維は緑色に色付けされます。 EDL (l) および SOL (m) 筋線維における中心核形成のパーセンテージ (グループあたり n = 4 または 5 匹のマウス)。 TA 筋におけるコラーゲン I 型アルファ 1 (n、o、Col1A1) および結合組織成長因子 (p、q、CTGF) のレベルを評価するために、ウェスタンブロット分析 (n、p) および定量化 (o、q) が実行されました ( １グループ当たりｎ＝４匹のマウス）。 TCEは、すべてのウェスタンブロットのローディングコントロールとして使用されました。コラーゲン含有量の浸潤レベルを評価するために、SOL 筋肉でマッソントリクローム染色 (r) および定量化 (s) を実行しました。スケールバー: 500 μm。線維症領域は青色で表示されます (マウスあたり n = 28 ～ 50 フィールドをカウント、グループあたり 3 匹のマウス)。 (e、f、h、j、l、m、o、q、s) ひげの最小値から最大値。ボックスの中央の線は中央値でプロットされます。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ns、有意ではない、P > 0.05; マン・ホイットニーの U 検定。 kDa、キロダルトン単位の相対分子量。

我々は以前、HDAC6 が筋萎縮に寄与していることを示しました 42。 TubA処理によりmdx筋肉で観察された繊維サイズの全体的な増加を考慮して、HDAC6の薬理学的阻害がmdxマウスの筋萎縮を減少させるメカニズムを調査しました（図2g、i）。この目的のために、筋萎縮に関与するタンパク質マーカーの発現をウェスタンブロットによって評価しました。 TubAは、MAFbx / アトロジン1の57％±11％の減少（P <0.05、図2h）、およびE3ユビキチンタンパク質リガーゼMuRF1 / TRIM63の35％±4％の減少（P <0.05、図2j）を引き起こしました。 mdx-veh動物と比較。これらのデータを総合すると、HDAC6 阻害により筋萎縮の主要なメディエーターの発現が減少することが示され、したがって筋線維のサイズの正常化の説明が得られます。

さらに、mdx 線維サイズの不均一性は、主に、壊死線維の喪失に続く小さな再生線維の存在によって生じます。中心核形成は、ジストロフィー性筋線維における筋肉損傷の重要な指標です 73,74。筋肉損傷の程度に対するTubAの効果を評価するために、ヘマトキシリンエオシン染色を使用して中心核を有する線維の数を評価した（図2k）。ＴｕｂＡは、核中心線維の数の有意な減少を引き起こした（ＥＤＬ筋では−１５％±２％、図２ｌ、ＳＯＬ筋では−２４％±２％、図２ｍ；ｍｄｘと比較して、両方ともＰ＜０．０５） -vehマウス）。さらに、筋線維の喪失は、線維化組織の進行性の蓄積を伴います75。したがって、我々は、mdx筋肉における線維症関連タンパク質の発現がTubAによって減少するかどうかをウェスタンブロットによって調査しました（図2n、p）。 I型コラーゲンアルファ1鎖（Col1A1）と結合組織成長因子（CTGF）のタンパク質レベルは両方とも、ビヒクル処理mdxマウスと比較して、TubAで処理されたmdxマウスで減少しました（-36％±7％、図2oおよび-16） % ± 1%、図 2q; それぞれ、P < 0.05)。これらの結果を確認するために、SOL（図2r）およびEDL筋肉（補足図2a）の凍結切片に対してマッソントリクローム染色を実行しました。ＴｕｂＡは、対照ｍｄｘＳＯＬ（ビヒクル処理）と比較して、ｍｄｘＳＯＬ筋肉の線維化領域を有意に減少させた（Ｐ＜０．００１；図２ｓ）。 EDL筋肉では、コラーゲン陽性表面全体に対するTubAの効果は有意に達しませんでした（ P > 0.05;補足図2b）。それにもかかわらず、TubA は mdx EDL 筋におけるコラーゲン含量の高い領域の形成を効率的に防止しました。まとめると、これらのデータは、ジストロフィー筋における HDAC6 阻害により中心核形成が減少し、線維サイズ分布が正常化され、小線維の割合が減少し、線維化が防止されることを示しています。

ジストロフィンとユートロフィン A は、DGC 複合体を微小管ネットワークに結び付けます 10,76。以前のデータ10,77と一致して、ウェスタンブロッティングと免疫蛍光染色によって、mdxマウスのTA筋線維とEDL筋線維は、WT-CTLマウスよりもそれぞれチューブリンと微小管密度が高いことを確認しました（P <0.05、図1dおよび補足）図図3a、b）。ただし、TubA処理は全体のα-チューブリン存在量に影響を与えませんでした（mdx-vehマウスと比較して P > 0.05;図1d）。健康な筋肉では、微小管ネットワークは縦方向、横方向、および核周囲の微小管からなる格子格子を形成しています78、79、80。ここで、WT-CTLマウスでは、横方向と縦方向の微小管がそれぞれ〜2μmと〜5μmの間隔で規則的に配置されていることを観察しました（矢印図3a、および補足図3c〜eを参照）。 mdx筋肉では、免疫蛍光実験により、格子状組織の喪失を伴う微小管ネットワークの崩壊が示されています（図3aの矢印を参照）。興味深いことに、TubAで処理したmdxマウスでは、微小管格子が回復しました（青と黄色の線スキャンと補足図3c〜eを参照）。さらに、微小管の方向性を分析するために特別に開発されたソフトウェアを使用して微小管ネットワークを分析しました81（TeDTプログラム、図3b）。 TeDT プログラム分析により、WT および TubA 処理 mdx マウスと比較して、ビヒクル処理 mdx 筋肉における横方向微小管 (90°付近に中心) の有意な減少が明らかになりました (mdx-veh マウスと比較して P < 0.05)。これらのデータは、TubA 治療が mdx 筋肉の微小管ネットワークの組織化を改善することを示しています。以前の研究 57,82 と一致して、これはさらに、HDAC6 阻害による微小管のアセチル化が微小管を安定化し、その横方向の配向を促進することを示しています。

a、c ビヒクル-DMSO（mdx-veh）またはTubA（mdx-TubA）で処理された11週齢のC57BL / 10マウス（WT-CTL）およびC57BL / 10ScSn-Dmdmdx/Jマウスから単離されたTAの線維。連続 30 日間を、β-チューブリンに対する抗体 (β-tub) で染色して MT ネットワーク (a、赤色) を標識するか、α-ブンガロトキシン-A488 (c、緑色、α-BTX-A488) で染色して NMJ を標識しました。。スケールバー: 25 μm。 b TeDT ソフトウェアを使用した MT ネットワーク組織分析 (3 匹のマウスからの n = 4 ～ 6 繊維)。最終的に生成されたグラフは、MT 配向の指定度ごとのグローバルスコアを示します。0 度および 180 度は縦方向 MT に対応し、90 度は横方向 MT に対応します。方向ヒストグラム (HD)。矢印は MT ネットワークの規則的な組織を表し、矢印は格子状の組織が失われ、MT ネットワークが組織化されていないことを示しています。 NMJ 終板の直径 (d) と NMJ のコンパクトさ (e) をグラフでまとめました。 d、e、*、**、および *** の mdx-veh マウスと mdx-TubA マウスの比較。マウスの各グループの中央値は頻度ヒストグラムの上に表示されます (n = 40 ～ 75 個の NMJ をカウント)。断片数の分布 (f) と断片化指数 (g) が定量化されました (NMJ の n = 43 ～ 73 がカウントされました)。 g ひげの最小値から最大値まで。ボックスの中央の線は中央値でプロットされます。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; (mdx-TubA 対 mdx-veh)、マン・ホイットニー U 検定。

mdx 筋で観察されるシナプス後アセチルコリン受容体 (AChR) の高度に断片化された分布は、ジストロフィンが NMJ83 の維持に関与していることを強く示唆しています。 HDAC6阻害によりNMJ57におけるAChR分布の緻密性が高まるため、対照および治療mdxマウスのNMJ組織を分析しました（図3c）。アセチルコリン受容体を視覚化するために使用されたα-ブンガロトキシン染色は、以前の研究から予想されたように、対照WT NMJと比較して対照mdx-veh処理マウスではNMJ組織が著しく損なわれていることを示しました（図3c、d）。より具体的には、WT筋肉と比較して、mdx-veh NMJの緻密さは26％±11％減少し（ P < 0.05、図3e）、NMJの全表面は38％±18％増加しました（ P <0.05）；図３ｄ）、断片化指数は約２倍増加し（Ｐ＜０．００１；図３ｇ）、ＮＭＪ当たりの断片の平均数は増加した（Ｐ＜０．００１；図３ｆ）。 TubA処理は、NMJ表面（ビヒクル処理mdx NMJと比較して-24％±13％、P <0.05;図3d）およびコンパクト性（ビヒクル処理mdx NMJと比較して+31.3％±12.5％、P <0.05）をほぼ正常に回復しました。 ;図3eおよび補足図3f、g)。ビヒクル処理mdxマウスと比較して、TubAはまた、断片化指数-13.2％±2％（P <0.05;図3g）およびNMJあたりの断片数（1〜1から構成されるNMJの+63％±1％）を部分的に正規化しました。 3 つのフラグメント、P < 0.05;図 3f)。全体として、TubA 処理は、AChR パッチの緻密性と動員の増加を介して、mdx マウス筋線維における正常な AChR 分布を部分的に回復しました。

ジストロフィンの転写は、mTOR 経路を介して制御されることも知られています87。実際、mTOR欠損は筋ジストロフィン含有量の減少につながり、重度のミオパシーにつながるジストロフィー性欠損を引き起こします。これに関連して、mTOR経路のさまざまな成分のリン酸化を測定することにより、mdx筋肉におけるHDAC6阻害がタンパク質合成を促進できるかどうかを調査しました（図4a）。 mTORタンパク質レベルはTubA処理によって有意に変化しませんでしたが（P = 0.342;図4b、c）、スレオニン389でのp70-S6キナーゼリン酸化の〜2倍の増加が観察されました（P <0.05;図4d、e）。 p70-S6キナーゼ活性の増加と一致して、Ser235-236およびSer240-244の両方でS6のリン酸化が約2倍増加することが観察されました（P<0.05;図4f、g、h）。最後に、TubA は、ホスホ-Thr37-46、ホスホの 4E-BP1 β アイソフォームに対する 4E-BP1 γ の比率の増加によって示されるように、mTOR 感受性部位における翻訳阻害剤 4E-BP1 のリン酸化の有意な増加を誘導しました。 -Thr70および合計4E-BP1（図4i、j、k、l）。まとめると、我々のデータは、TubA による 30 日間の治療が mTOR 経路を介して mdx マウスの筋タンパク質合成を刺激することを示しています。

mTOR の下流ターゲットの概略図。 TubA (mdx-TubA) またはビヒクル-DMSO (mdx-veh) で連続 30 日間処置した生後 11 週齢の C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J マウスの TA 筋肉をウェスタンブロット分析によって分析しました (b、d、 f、i)。 mTOR (c)、pp70 S6 キナーゼ (e、T389)、pS6 (g、S240/244)、pS6 (h、S235/236)、p4E-BP1 (j、T37/46)、p4E-BP1 (k) の定量、Ｔ７０）、および４Ｅ−ＢＰ１（１）を実施した（１群当たりｎ＝４匹のマウス）。 TCEをローディングコントロールとして使用しました。 (c、e、g、h、j、k、l) ひげの最小値から最大値まで。ボックスの中央の線は中央値でプロットされます。 *P < 0.05; ns、有意ではない、P > 0.05; マン・ホイットニーの U 検定。 kDa、キロダルトン単位の相対分子量。

mTOR 経路に対する TubA の効果が培養筋細胞でも観察されたかどうかを確認するために、C2C12 筋管を TubA で 24 時間前処理した後、mTOR 複合体 1 (mTORC1) の選択的阻害剤であるラパマイシンで処理しました (補足図4a)。処理後、S6タンパク質のリン酸化をウェスタンブロットにより全細胞抽出物で評価しました（補足図4b）。予想どおり、インビボデータに基づいて、TubAでの処理は、ビヒクル処理細胞と比較して、C2C12筋細胞のS6リン酸化を増加させました（補足図4c、d）。ラパマイシンの存在下では、TubAの存在または非存在の両方で、S6リン酸化は大幅に減少しました（ P < 0.001;補足図4c、d）。したがって、HDAC6 阻害は mTOR 複合体の上流で作用して経路を活性化します。これらの実験では、TubA 処理によるユートロフィン A 発現の増加が mTOR 経路に依存しているかどうかも評価しました。ユートロフィン A 発現は、ラパマイシンの存在下または非存在下で TubA の存在下で評価されました。ラパマイシンはTubAによるユートロフィンAの上方制御を妨げ、TubAによって誘導されるユートロフィンAの増加にはmTOR経路が関与していることを示しています（補足図4f）。 mTOR シグナル伝達と TGF-β シグナル伝達はどちらも筋肉量調節の重要な役割を果たしており、これらの経路は相互に関連しています 37,88。

mTOR 経路、筋萎縮および線維症に対する TubA の影響により、HDAC6 阻害が TGF-β シグナル伝達に影響を与えるかどうかを検討するようになりました。 TGF-β メンバーのミオスタチンによって誘発される筋萎縮には、MAFbx 発現を活性化し、mTOR シグナル伝達を下方制御する Smad2/3 シグナル伝達が関与します 89,90。 Smad2/3 タンパク質が核内に入り、その標的遺伝子を活性化するにはリン酸化が必要です 91。興味深いことに、Smad2/3 タンパク質も核内でアセチル化されることが示されています 92,93。マウス C2C12 筋芽細胞を、ビヒクル (DMSO)、TubA、または TGF-β/アクチビン/NODAL 経路の特異的阻害剤である SB431542 (SB43) のいずれかで 24 時間処理しました 94。阻害剤を除去した後、C2C12 筋芽細胞を組換えヒト TGF-β195 (rhTGF-β1) に 30 分間曝露し、抗アセチル化チューブリンおよび抗 Smad2/3 抗体を用いた免疫蛍光法により Smad2/3 の細胞内局在を分析しました。

TubA処理は、rhTGF-β1の存在下と非存在下で同様にチューブリンのアセチル化を増加させ、TGF-βシグナル伝達がHDAC6デアセチラーゼ活性に影響を与えないことを示しました（図5aおよび補足図3a、c）。予想通り 96,97 、rhTGF-β1 処理は、それぞれセリン 465-467 および 423-425 での Smad2/3 リン酸化を増加させました（補足図 3b）。一貫して、C2C12細胞における免疫蛍光実験とウェスタンブロット実験は、それぞれrhTGF-β1がSB43によってブロックされたSmad2 / 3のリン酸化と核蓄積を増加させることを示しました（図5a、bおよび補足図5a〜d）。 TubAの存在下では、Smad2 / 3のリン酸化と核蓄積が大幅に減少し（図5a〜d、f〜h、および補足図5a〜d）、これらの減少はSmad3のアセチル化の増加と相関していました（P < 0.05、図5e)。これらの結果を確認するために、TubA の存在下または非存在下で細胞分画を実行し、サイトゾル画分 (CE) と核画分を分離し、後者はさらに核抽出物 (NE) とクロマチン抽出物 (Chrm) に細分しました。。 TubAの存在下では、核ホスホSmad3と細胞質ホスホSmad3の細胞質比が逆転し、HDAC6阻害によりSmad3核移行が減少したことが確認された（図5f、g）。

a〜e HDAC6阻害剤（TubA、5μM）、TGF-β1の選択的阻害剤（SB43、5μM）、またはDMSO（CTL）のいずれかで24時間前処理した4日齢のC2C12筋芽細胞。次いで、筋芽細胞を組換えヒトTGF-β1 (rhTGF-β1; 10 ng/mL)で30分間処理した。 a 筋芽細胞は、Smad2/3 (緑色) およびアセチル化チューブリン (ac-tub、赤色) に対する抗体で二重染色されました。核は DAPI (青色) で標識されました。スケールバー: 50 μm。 b 3 つの独立した実験からの Smad2/3 蛍光強度の核分布のグラフ概要。二元配置分散分析 (TubA + rhTGF-β1 対 DMSO + rhTGF-β1)。 c Smad2/3リン酸化（pSmad）、Smad2/3アセチル化（ac-Smad）、Smad2/3、アセチル化α-チューブリン（ac-tub）、およびα-チューブリン（α-tub）のレベルをウェスタンブロット分析によって視覚化しました。。 C2C12細胞におけるSmad2/3リン酸化（d）およびSmad3アセチル化（e）のレベルを評価するために、定量化が行われました（n = 5の独立した実験が定量化されました）。マン・ホイットニーの U 検定。 f、g 3つの画分への細胞の分画を実行しました：サイトゾル画分（CE）、核抽出物（NE）、およびクロマチン抽出物（Chrm）。 f Smad3 リン酸化 (S423-425)、Smad2/3、アセチル化α-チューブリン (ac-tub-K40)、GAPDH、HIRA、およびヒストン H3 (H3) のレベルを、3 つの独立した実験からウエスタンブロットによって視覚化しました。 g Smad3 リン酸化の分布の定量化 (S423-425)。二元配置分散分析。クロマチン免疫沈降 (ChIP) は、Smad2/3 に対する抗体を使用して実行されました。 MAFbx (h) または MuRF1 (i) 遺伝子の免疫沈降プロモーター領域の qPCR 増幅を使用して、免疫沈降物中のこれらの DNA 断片の存在を検出しました (h、i、n = 3 つの独立した実験)。マン・ホイットニーの U 検定。 *、P < 0.05。 (j、k、l、m、n) ビヒクル-DMSO (mdx-veh) または TubA (mdx-TubA) で連続 30 日間治療した生後 11 週齢の C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J マウスを分析しました。ウェスタンブロット分析による TA 筋肉 (j) および定量化 (k、l、m、n)。 TA 筋における Smad3 アセチル化 (k)、Smad2 アセチル化 (l)、Smad3 リン酸化 (m)、および Smad2/3 (n) のレベルを評価するために、定量化が行われました (グループあたり n = 4 マウス)。マン・ホイットニーの U 検定。 TCEは、すべてのウェスタンブロットのローディングコントロールとして使用されました。 (d、e、k、l、m、n) ひげの最小値から最大値まで。ボックスの中央の線は中央値でプロットされます。 (b、g、h、i) データは平均値 ± SEM として表示されます。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ns、有意ではない、P > 0.05。 kDa、キロダルトン単位の相対分子量。

この細胞再分布の機能的影響を調査し、TubA が Smad2/3 標的遺伝子の活性化に影響を与えるかどうかを判断するために、rhTGF-β1 または rhTGF-β1 と TubA で処理した C2C12 細胞に対して Smad2/3 ChIP アッセイを実行しました。推定上のSmad結合部位は、MAFbxおよびMuRF1のプロモーターにおける転写開始部位の上流、すなわちMAFbxについては位置-618と-424の間および位置-319と-205の間、および位置-727と-608の間でソフトウェア分析によって同定された。 MURF1用。 -1978から-1805および-1320から-1232のプロモーター領域を、それぞれMAFbxおよびMURF1のネガティブコントロールとして使用しました。 TubA の存在により、MAFbx (-63% ± 12% および -34% ± 4%) および MURF1 (-38% ± 7%) のプロモーターへの Smad2/3 の結合が、予測結合領域で大幅に減少しました (P < 0.05;図 5h、i)、これは細胞分画データをうまく補完します。

TGF-β シグナル伝達は、ジストロフィー筋において上方制御されることが知られています 98。 HDAC6阻害がTGF-βシグナル伝達を下方制御することをin vivoで確認するために、ビヒクル-DMSOまたはTubAで処理したmdxマウスのTA筋肉におけるSmad2 / 3のアセチル化およびリン酸化をウェスタンブロットによって評価しました（図5j）。 TubA処理mdxマウスでは、Lys19上のSmad3のアセチル化はDMSO処理mdxマウスよりもほぼ3倍高かった（P < 0.05、図5k）が、Smad2のアセチル化は影響を受けなかった（P > 0.05、図5l）。 Smad3 アセチル化のこの増加は、Smad3 の Ser432-425 におけるリン酸化の 55% ± 4% の減少と並行していました (P < 0.05; 図 5m)。 mdx マウスでは、TubA 処理により、mdx-veh 動物と比較して Smad2/3 の総レベルが増加する傾向がありました。ただし、この増加は統計的に有意ではありませんでした（P = 0.0571、図5n）。 Smad4およびSmad7レベルに対するTubAの効果も評価されましたが、対照との差は観察されませんでした（補足図5e-h）。

mTOR 経路と TGF-β/Smad 経路を結び付ける機構はまだ十分に理解されていません。それにもかかわらず、Smad3はPTEN mRNAの翻訳を活性化し、それによってAkt / mTORシグナル伝達とタンパク質合成を阻害することが以前に示されていました39（補足図5i）。したがって、我々は、TubAによるSmad 3阻害に続くPTEN発現の下方制御の可能性を調査した。 mdx マウスの筋肉と C2C12 細胞の両方で、TubA は PTEN タンパク質レベルの減少を誘導しました（P < 0.05;補足図5j–m）。 Aktタンパク質レベルとリン酸化も調べられ、PTENレベルの減少と一致して、Akt1とAkt2の両方のタンパク質レベルとリン酸化がTubAの存在下で増加しました（ P <0.05;補足図5n-s）。まとめると、これは、TubA が Smad3 および PTEN を介して mTOR 経路を活性化する可能性が最も高いことを示しています。

ここで、我々は、mdx マウスおよび C2C12 筋細胞における TubA による HDAC6 阻害の効果を評価しました。 TubA 治療は mdx 筋機能を大幅に改善し、全体的な組織病理学的ジストロフィーの特徴を減少させました。 HDAC6の作用機序を探索する中で、HDAC6がSmad3のアセチル化を介してTGF-βシグナル伝達を調節していることを発見し、Smad3がHDAC6の新たな標的であることが同定された。 TubA は Smad3 のアセチル化を増加させ、Smad2/3 のリン酸化と核移行を防止し、それによって MAFbx や MuRF1 などのアトロゲンの発現を減少させ、mTOR 経路を上方制御します。まとめると、このメカニズムは、mdx 筋の筋萎縮および線維化に対抗するための HDAC6 阻害の有益な効果を説明できます (図 6)。

TubA などの HDAC6 阻害剤は、HDAC6 活性の低下を誘導し、α-チューブリンと Smad3 のアセチル化を引き起こします。 HDAC6 の薬理学的阻害により、α-チューブリンのアセチル化が増加して DGC が回復し、MT ネットワーク/NMJ 組織が安定化します。さらに、HDAC6 の特異的阻害により Smad3 のアセチル化が増加し、TGF-β シグナル伝達に干渉して、MAFbx/MuRF1 などの重要なアクターの発現を低下させることで筋萎縮を軽減し、mTOR 経路を介してタンパク質合成を刺激します。我々の結果は、HDAC6 が DMD の興味深い薬理学的標的であることを特定しました。

HDAC6 は体内の組織全体で広く発現しています 38。がんでは、HDAC6 が過剰発現され、予後不良と相関することが知られています99,100。ここでは、HDAC6 発現が mdx マウスで増加していることを観察しました。これは、HDAC6 が DMD 病理に関与している可能性があることを示しています。この考えと一致して、TubAによるHDAC6の選択的阻害は、HDAC6の発現レベルに影響を与えることなく、mdxマウス筋肉の複数の病理学的特徴を減少させた。これは、HDAC6 阻害の有益な効果は、そのタンパク質レベルとは無関係に、その脱アセチラーゼ活性の低下にあることを示唆しています。

我々の結果は、微小管の脱アセチル化を防止して微小管を安定化させると、ジストロフィン欠損筋における微小管の組織が維持されることを示している。 mdx 筋における力生成の損失は、一般に筋線維細胞骨格の構造的障害とシグナル伝達の変化に起因すると考えられています 101。興味深いことに、微小管ネットワークの安定化は収縮誘発損傷から保護することが示されており、微小管細胞骨格を標的とすることがDMD77における治療介入の新たな機会を提供する可能性があることを示唆している。したがって、TubA で処理した mdx 筋肉には中心核形成線維が少なく、これはおそらく筋線維の抵抗性が高いためです。

我々のデータは、TubAがmdxマウスのNMJ形態を部分的に回復することを示しています。 DMD 患者と mdx マウスでは、NMJ が著しく乱れており、神経筋機能/伝達の欠損を示しているため、機能の変化とジストロフィー筋の回復における NMJ 障害の寄与が強調されています 83,102,103,104。我々は最近、HDAC6 が AChR 分布と NMJ 組織化を調節することにより、NMJ における微小管組織化に関与していることを示しました 57。 mdx マウスでは、NMJ の微小管の構造変化が NMJ85 の組織化に関与していると考えられます。我々の現在の研究は、微小管を安定化することによるNMJ構造の保護が、おそらくmdx筋機能に対するTubA治療の有益な効果に関与していることを示しています。 mdx 筋では、断片化により NMJ が異常に大きくなり、今回の結果は、微小管ネットワークの安定化によってこの断片化が制限されることを示しています。これは、微小管のアセチル化の増加が NMJ58 の拡散を制限することを示した以前の結果と一致しています。ユートロフィン A レベルの増加は、TubA による NMJ 組織の改善にも関与している可能性があります。

ユートロフィン A レベルの大幅な増加は、DMD 患者の予後の改善と相関します 105。したがって、シナプス外ユートロフィン A レベルを増加させる HDAC6 阻害の能力は、おそらく mdx 筋肉の完全性の維持に関与しています。 HDAC6 がどのようにユートロフィン A を調節するかはまだ解明されていないが、我々はここでラパマイシンが TubA によるユートロフィン A 発現の増加を防止することを観察し、これは mTOR 経路の関与を示している。 TubA のさらなる有益な作用は、微小管ネットワークの修復によって媒介される可能性もあり、これによりユートロフィン A の膜への輸送が改善される可能性があります。

転写調節複合体を介して遺伝子発現に直接作用するほとんどの HDAC とは対照的に、HDAC6 は厳密に細胞質であり、その既知の基質はいずれも転写因子ではありません。ここでは、HDAC6 が Smad3 を脱アセチル化し、その核内蓄積を調節することを示します。 Smad2/3 タンパク質は、TGF-β シグナル伝達の作用を媒介して、タンパク質の異化と線維化を促進し、タンパク質の同化を阻害します。したがって、HDAC6 阻害による Smad2/3 核内蓄積の阻害は、腎線維症 106、筋萎縮の軽減、および mTOR 経路を介したタンパク質合成刺激に対する TubA の有益な効果を説明できます。ジビノスタットなどの HDAC 阻害剤の有益な効果は、mdx マウスおよび DMD 患者においてアクチビン結合タンパク質フォリスタチンの発現を刺激することが以前に実証されており、その主な活性は TGF-β シグナル伝達をブロックすることです 27,56,107。 mdx 筋肉に対する HDAC6 のこれらの有益な効果は、ジビノスタットの効果を再現しています。さらに、mdx および DMD 患者の筋肉では、TGF-β 活性の阻害により、変性と線維石灰化 108 および線維症 27 の両方が軽減されます。一貫して、HDAC6 阻害により mdx 筋肉の線維化も減少しました。

TGF-β シグナル伝達に対する TubA の効果を mTOR に結び付ける試みにおいて、我々は PTEN 発現が TubA によって減少することを観察し、PTEN 翻訳の活性化における Smad3 の既知の役割を指摘しました 37。 DMD 患者および mdx マウスのジストロフィー筋では PTEN レベルが上昇していることが知られており、PTEN 阻害は mdx マウスの筋肉の再生と機能を改善することが示されています 109。したがって、PTEN 発現に対する TubA の効果は、mdx 筋の改善に関与している可能性があります。

興味深いことに、HDAC6 は、他の HDAC で示されているように個々の遺伝子の発現に直接影響を与えるのではなく、細胞質内の Smad3 を標的とすることによって TGF-β シグナル伝達に作用します。したがって、HDAC6 は Smad2/3 の下流標的を調節し、TGF-β シグナル伝達を妨害する新規の薬理学的侵入を提供します。 Smad2 と Smad3 は 92% の配列同一性を共有しますが、それらの機能は完全に重複しているわけではありません。 Smad2 ノックアウトマウスは、血管および頭蓋の異常と左右のパターン形成の障害を伴って胎生 10.5 日目に死亡します 110,111 のに対し、Smad3 ノックアウトマウスは生存できますが、免疫機能の障害と慢性炎症を患っています 112,113。さらに、それらは特定の転写因子との結合を好みます。たとえば、Smad3 は Smad232 よりも FoxO と優先的に対話します。興味深いことに、Smad2/3 アセチル化に関する以前の報告はもっぱら核因子に関係しており 92,93、Smad2/3 アセチル化の効果はプロモーター結合、トランス活性化活性、核外輸送、またはタンパク質の安定性と相関していました。核内では、Smad3 は TGF-β に応答して p300/CBP によってリジン 19 でアセチル化され、その DNA 結合活性と標的遺伝子プロモーターへの結合が増加します 114。 Smad3 のアセチル化は、TGF-β 制御遺伝子の発現を選択的に上方制御または下方制御する可能性があります。注目すべきことに、Smad3 は他のいくつかのリジンでもアセチル化され得る 92,93。 HDAC6 は厳密に細胞質であるため、HDAC6 による Smad3 の脱アセチル化はおそらく異なるプロセスに影響を及ぼします。我々の結果は、Smad3のアセチル化が増加すると、Smad3のリン酸化とその核内蓄積が減少することを示しています。したがって、細胞質における Smad3 の脱アセチル化を防止すると、TGF-β 受容体によるそのリン酸化が減少し、および/または Smad4 との結合が減少すると推測できます。つまり、核内の Smad3 アセチル化は標的遺伝子の発現を活性化するために必要ですが、細胞質内の Smad3 アセチル化はその機能を阻害します。興味深いことに、Smad2とSmad3の間の類似性は高いにもかかわらず、HDAC6阻害はSmad3のアセチル化を選択的に増加させ、さらにSmad2とSmad3の両方のリン酸化と核侵入に影響を与えました。私たちは、細胞質内のアセチル化 Smad3 が Smad2 に結合してそのリン酸化を阻害し、アセチル化 Smad2/3 二量体の形成により核への侵入能力が低下する可能性があると仮説を立てています。 p300による活性化後、核から細胞質に輸出されるアセチル化Smad2/3分子は、TGF-β経路への再侵入を可能にするためにHDAC6による脱アセチル化を必要とすることが考えられる。したがって、HDAC6阻害は細胞質におけるSmad3の脱アセチル化を防止し、それによってTGF-βシグナル伝達に参加できるSmad2/3の量を減少させ、細胞質のSmad2/3の量を増加させると考えられる。別の可能性は、HDAC6 による Smad3 の脱アセチル化がそのユビキチン化とその後の分解を制御しているということです。どちらの仮説も、HDAC6 阻害により細胞質 Smad2/3 タンパク質の量が増加するという事実と一致しています。

HDAC6 と TGF-β の間の機能的関連は以前に報告されています。実際、Smad3 のリン酸化と核蓄積は HDAC6106,115 によって調節されていることが示されました。 TGF-β は、HDAC6 による α-チューブリンの脱アセチル化を誘導し、細胞運動性の増加をもたらし 115、微小管の安定性が TGF-β 誘導 Smad リン酸化を制御することも示されています 116、117、118。ここで、HDAC6 が Smad3 と微小管のアセチル化の両方を調節していることを示すことにより、我々の結果は、微小管の安定性と TGF-β シグナル伝達の間の直接的な分子的関連性を提供します。

以前の研究で、我々は、HDAC6 発現が筋萎縮中に増加し、それがユビキチンリガーゼ MAFbx42 との直接相互作用を介して筋消耗に関与していることを示しました。したがって、我々は、HDAC6 阻害により、Smad2/3 を介した TGF-β シグナル伝達の阻害と、ユビキチン化とその後の MAFbx 基質の分解の阻害の 2 つのレベルで筋タンパク質の分解が防止されると提案します。 TGF-β シグナル伝達の阻害は、マウスモデルにおける悪液質と癌の進行を制限するのに有益であることも示されました 119,120。多くの腫瘍は TGF-β を分泌し、HDAC6 が TGF-β を調節するという発見は、HDAC6 阻害剤によって癌の進行に対して観察される有益な効果を説明するのにも関連する可能性があります 53,54,121。

要約すると、我々の結果は、HDAC6 の薬理学的阻害が、3 つの相補的な機構を介してジストロフィン欠損マウスの骨格筋のいくつかの機能的、生化学的、および形態学的マーカーを大幅に改善することを示しています（図 6）：（i）NMJ および DGC の回復に有利な微小管の安定化、 (ii) ユートロフィン A レベルの増加、(iii) 筋萎縮、線維症を軽減し、タンパク質合成を刺激する Smad3 ターゲティングによる TGF-β シグナル伝達の阻害。したがって、薬剤によるHDAC6阻害はDMDの魅力的な治療標的となり、投与の容易さ、すべての筋肉への影響、ジストロフィン変異に関係なくすべての患者への利益など多くの利点を提供します。

動物を使用するすべての手順は施設倫理委員会によって承認され、実験動物の管理と使用に関する米国研究評議会ガイドおよびオタワ大学動物管理委員会のガイドラインに従いました。すべての手順は、カナダ動物管理評議会のガイドラインに従って行われました。インビボ実験では、雄対照C57 black 10 (C57BL10)と雄C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J mdxの両方を使用しました(The Jackson Laboratory Bar Harbor、USA)。すべての動物は、病原体のない特定の条件下で維持されました。これらのマウスは、温度制御 (23 °C ± 0.9 °C)、湿度 50% ± 4%、餌と水が自由に摂取できる施設で、12 時間明/12 時間暗サイクルで飼育されました。 Mdx マウスを、2% DMSO に可溶化したツバスタチン A (TubA、APExBIO、#A4101; 25 mg/kg/日、腹腔内) または 2% DMSO を添加した生理食塩水 (溶媒対照) のいずれかで連続 30 日間治療しました 46。これらのマウスは、オタワ大学の動物管理獣医局で維持されました。すべての動物の仕事は、関連するすべての倫理規制に準拠しています。処置後、マウスをイソフルラン麻酔（装置ＴＥＭＳＥＧＡ、ＭｉｎｉＴａｇＶ１／ＥｖａｐｏｒａｔｏｒＴｅｃ７の参照ＶＩ－１５８６）で麻酔し、頸椎脱臼により安楽死させた。次に、筋肉を解剖し、(i) タンパク質と RNA を抽出するために液体窒素中で凍結および粉砕するか、(ii) クライオスタットのために Tissue-Tek OCT コンパウンド (VWR、ミシソーガ、カナダ) に包埋し、液体窒素で冷却したイソペンタン中で凍結するかのいずれかを行います。切片化57 または (iii) 以下の変更を加えて手動で解離80した: 単一の TA ファイバーを PBS-4% パラホルムアルデヒド中で室温で 30 分間固定し、飽和およびインキュベーションの前に PBS-1% Triton X-100 中で 30 °C で 60 分間透過処理した以下に説明するように抗体を使用します。

すべての注射と行動試験は、オタワ大学動物行動中核施設で盲検法で実施されました。 TubA 実験では、行動試験期間中毎日注射を続けました。干渉を最小限に抑えるために、注射は各テストの完了後の午後に実行されました。各試験の前に、マウスを少なくとも 30 分間部屋に慣れさせ、通常の光条件下で試験を実施しました。最初の試験の前に、マウスを 3 日間 1 日 1 回扱った。各動物の筋力を、握力計（Chatillion DFE II、Columbus Instruments）を使用してすべての足で測定した（後肢握力試験）。マウスがプローブをしっかりと握るまで、マウスをメーターに近づけました。マウスがプローブを解放するまで、約 2.5 cm/s の速度でバーから水平に引き離されました。最大ピーク力の値を記録しました (gF)。これを各動物について 15 秒間隔で 8 回繰り返しました。 30日目の各動物において、最良のスコアを特定の最大力として定義した。握力の測定は、ばらつきを抑えるために同じ研究者によってランダムな順序で行われました。測定を行った研究者は、試験の際、個々のマウスの治療グループについては知らされていませんでした。

C2C12 細胞 (ATCC、CRL-1772) をマトリゲルでコーティングした (matrigel® マトリックス、Corning) 直径 35 mm プレートに播種し、10% ウシ胎児血清と 1% を補充したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) 中で筋芽細胞として維持しました。ペニシリン - ストレプトマイシン (マルチセル)。次いで、細胞を分化培地（２％ウマ血清を補充したＤＭＥＭ培地、ＢｉｏＭｅｄｉａＣａｎａｄａ）中で分化させた。直径35 mmのプレートで増殖させた細胞をウェスタンブロットまたは免疫蛍光で処理しました。ウェスタンブロットでは、細胞をトリプシン処理によって収集し、PBSで洗浄し、遠心分離し、使用するまで-20℃で保存しました。免疫蛍光の場合、細胞を PBS-4% パラホルムアルデヒド中で室温で 20 分間固定し、PBS で洗浄し、使用するまで 4 °C で保存しました。

C2C12 細胞をさまざまな薬物で処理しました: TubA (5 µM、APExBIO、#A4101)、tubacin (TBC、5 µM、Sigma、#SML0065)、ラパマイシン (rapa、100 nM、Sigma #CAS 53123-88-9) SB 431542 (SB43、10 μM、Tocris、#1614)。組換えヒト TGF-β1 (rhTGF-β1、10 ng/mL、#100-21) は PeproTech から購入しました。この研究で使用したすべての一次抗体を補足の表 1 に示します。免疫蛍光研究に使用した二次抗体は、Alexa-Fluor 488 または Alexa-Fluor 555 (Molecular Probes) に結合しました。またはCy3またはCy5 (Jackson ImmunoResearch Laboratories)。ウェスタンブロッティングに使用した二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 結合抗ウサギ IgG ポリクローナル抗体 (Bio-Rad) または HRP ヤギ抗マウス IgG 抗体 (Bio-Rad) のいずれかでした。この研究で使用されたすべての抗体は、メーカーによって、または研究室から以前に発表された研究によって検証されました。免疫蛍光研究のために NMJ を視覚化するために、Alexa-Fluor 488 (Molecular Probes、# B13422) と 5 μg/mL のα-ブンガロトキシン複合体を使用し、核 DNA を染色するために DAPI (Sigma-Aldrich、# D9542) を使用しました。ウェスタンブロットでタンパク質を視覚化し定量するために、2,2,2-トリクロロエタノール 122 (TCE、Sigma、#T54801) を使用しました。

成体マウスの後肢から TA 筋肉を収集し、解剖した筋肉をドライアイス上で粉砕しました。筋肉粉末を尿素/チオ尿素緩衝液 [7 M 尿素、2 M チオ尿素、65 mM チャップス、100 mM DTT、10 U DNase I、プロテアーゼ阻害剤 (Complete; Roche/Sigma-Aldrich)] に再懸濁し、タンパク質濃度を CB- Xタンパク質アッセイキット(G-Bioscience、セントルイス、ミズーリ州)。トリプシン処理後、C2C12 細胞を RIPA バッファー [50 mM Tris-HCl、pH 8.0、150 mM NaCl、1% NP-40、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS およびプロテアーゼ阻害剤 (Complete; Roche/Sigma-Aldrich)] で可溶化しました。 ]。タンパク質濃度は、メーカーの推奨に従ってBCAタンパク質アッセイキット(Pierce/ThermoFisher Scientific)を使用して測定しました。

5 ～ 20 μg の総タンパク質を 0.5% TCE を添加した SDS-PAGE で分離し、ニトロセルロースまたは PVDF 膜に転写しました。非特異的結合は、0.1% Tween を添加した 1X PBS で希釈した 4% ウシ血清アルブミン (BSA、Euromedex) でブロックし、膜を一次抗体とインキュベートしました。 0.1% Tween 1X PBS で十分に洗浄した後、メンブレンをホースラディッシュペルオキシダーゼ (HRP) 結合二次抗体 (Jackson Immunoresearch Laboratories/Cederlane) とともにインキュベートしました。さらに洗浄した後、ECL 基質試薬 (Bio-Rad) を使用してシグナルを明らかにし、ChemiDocTM MP イメージングシステム (Bio-Rad) を使用して取得するか、X 線フィルム (Fisher Scientific) でオートラジオグラフィーを行いました。 TCE 膜に基づく定量は、Image Lab ソフトウェア (Bio-Rad) または FIJI ソフトウェア (ImageJ 2.0.0-rc-69/1.52n、National Institutes of Health、メリーランド州ベセスダ) を使用して実行されました。

凍結した EDL および SOL 筋肉サンプルを、さらに処理する前に、-20 °C でクライオスタット (HM 525 NX、Thermo Fisher Scientific) に少なくとも 20 分間入れました。厚さ 10 μm の筋肉切片を横方向に切断しました。筋肉の断面をヘマトキシリンおよびエオシン色素で染色しました。 70%、90%、および 100% エタノール溶液を使用して切片を脱水し、トルエンで洗浄しました。切片は Permount (Thermo Fisher Scientific) を使用してマウントされ、オタワ大学細胞生物学および画像取得コア (RRID: SCR_021845) の落射蛍光 EVOS FLAuto2 倒立顕微鏡を使用して視覚化されました。中心核形成の割合は、Northern Eclipse Software (NES、EMPIX Imaging) を使用して、6 ～ 8 枚の断面図から筋線維の総数と中心核形成筋線維の数を計数することによって決定されました。マッソントリクローム染色は、オタワ大学ルイーズペルティエ組織学コア施設 (RRID:SCR_021737) でヒラメ筋および EDL クライオスタットの断面に対して実施されました。切片をブアン液（飽和ピクリン酸 75 mL、37 ～ 40% ホルムアルデヒド 25 mL、氷酢酸 5 mL）中で 56 °C で 1 時間固定し、黄色が消えるまで流水ですすいだ。次に、切片をワイゲルトヘマトキシリン（等量の溶液 A: 1 g ヘマトキシリン、100 ml 95% アルコール、および溶液 B: 4 ml 29% 塩化第二鉄、95 ml 蒸留水、1 ml 氷酢酸）で 10 分間染色しました。流水で１０分間洗浄した。切片をビーブリッヒスカーレット酸フクシン溶液（９０ｍＬの１％ビーブリッヒスカーレット水溶液、１０ｍＬの１％酸性フクシン水溶液、１ｍＬの氷酢酸）中で２分間染色し、水ですすいだ。スライドをリンモリブデン酸-リンタングステン酸溶液 (リンモリブデン酸 2.5 g、リンタングステン酸 2.5 g、蒸留水 120 mL) 中で 10 ～ 15 分間インキュベートし、アニリンブルー溶液 (アニリンブルー 2.5 g、氷酢酸 2 ml、100 mL) で染色しました。蒸留水）を5分間洗浄し、すすぎ、1%酢酸溶液に3〜5分間置き、95%および無水エチルアルコールで脱水し、キシレンで透明にし、カバースリップでマウントします。切片はZeiss Axio Scanで画像化されました。 Z1 にはプランアポクロマート 20x/0.8 対物レンズが装備されています。核は黒、細胞質は赤、コラーゲンは青に染色されます。

PBS-0.1% Tween 20中の一次抗体とのインキュベーションは、室温で60分間(C2C12細胞)、または4℃で一晩(分離された解離筋線維)のいずれかで実行され、洗浄されました。蛍光二次抗体とともに室温で 1 ～ 3 時間インキュベートした後、核 DNA を DAPI で 10 分間染色しました。カバースリップを、FluorSaveTM 試薬 (Calbiochem) を使用して顕微鏡スライド上にマウントしました。画像は、INMG の 63 × 1.4-NA 対物レンズを備えた AiryScan1 検出器を備えた Zeiss LSM880 顕微鏡 (Carl Zeiss) または 63 × 1.4-NA のいずれかを備えた Zeiss Axio Imager M2 (Carl Zeiss) 正立顕微鏡のいずれかで室温でキャプチャされました。 NA またはオタワ大学の細胞生物学および画像取得コア施設 (RRID: SCR_021845) にある 10 × 0.45 NA 対物レンズおよび AxioCam mRm CCD 検出器。すべての画像は、ZEN blue ソフトウェア、Zeiss AxioVision ソフトウェア (Zeiss、オーバーコッヘン、ドイツ)、Photoshop CS5 (Abobe Systems、サンノゼ、カリフォルニア州、米国)、または FIJI ソフトウェア (ImageJ 2.0.0-rc-69/1.52n) のいずれかで処理されました。、国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ）。 ImageJ80 の「name_randomizer」マクロを使用してファイル名を数字でランダムに変更することにより、画像をブラインド方式で分析しました。

C2C12 細胞を TubA で 24 時間前処理し、その後 TGF-β1 で 30 分間処理しました。次に細胞を収集し、300 g、4 °C で 3 分間ペレット化しました。ペレットを、1 x プロテアーゼ阻害剤カクテルおよび 1 x ホスファターゼ阻害剤カクテルを補充した 10 容量の氷冷 E1 緩衝液 (20 mM NaOH pH 7.6、5 mM 酢酸カリウム、0.5 mM MgCl2) で再懸濁し、1 mL ダウンスホモジナイザーに入れた。細胞を緩い乳棒で 25 ストロークしてホモジナイズし、氷上で 10 分間インキュベートした後、2100 × g、4 °C で 3 分間遠心分離しました。上清を収集し（細胞質抽出物、CE）、ペレットを600 mM NaClを補充した同量のE1緩衝液に再懸濁した。懸濁液を氷上で 30 分間インキュベートし、20,000 × g で 20 分間遠心分離しました。上清を回収し（核抽出物、NE）、ペレットを600 mM NaClおよびベンゾナーゼ（1/1000、Millipore、71205）を補充した同量のE1緩衝液に再懸濁し、クロマチン抽出物（Chrm）に対応させた。同量の各画分を Any kD Mini PROTEAN TGX ゲル (Biorad) にロードし、ニトロセルロース膜ブロッティングに移し、指定の抗体で明らかにしました。

アトロゲン (MAFbx および MuRF1) のプロモーター配列上に位置する Smad2/3 タンパク質のクロマチン免疫沈降 (ChIP) は、SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit (Cell Signaling Technology) を使用して次のように実行されました。 C2C12 細胞は、次のように前処理または未処理でした。 TubA で 24 時間、その後 TGF-β1 で 30 分間処理します。細胞を、ウシ胎児血清の非存在下で５ｍＬの細胞培養培地（ＤＭＥＭＧｌｕｔａｍａｘ）中で洗浄した。次に細胞を、1%パラホルムアルデヒドを添加したDMEM Glutamax中で25℃で10分間インキュベートしました。グリシンを最終濃度 0.125 M まで添加し、25 °C で 15 分間インキュベートすることによって架橋を停止しました。プレートをこすって細胞を PBS 1X に収集し、PBS 1X で洗浄し、1X プロテアーゼ阻害剤カクテルを 2.107 細胞/mL の濃度で含む ChIP 超音波処理細胞溶解バッファー (SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit) に再懸濁しました。氷上で 15 分間放置した後、4 ℃、3000 g で 3 分間遠心分離して細胞を収集し、1X プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む ChIP 超音波処理細胞溶解バッファーに再懸濁しました。氷上で５分間置いた後、この最後のステップを１０分間３回繰り返した。細胞を、1 mL チューブ内の Covaris S220 (ピーク出力: 140; デューティーファクター 10; サイクル/バースト: 200) 内で 4 °C で 12 分間超音波処理しました。超音波処理の効率を 1% アガロースゲルで制御して、500 ～ 1000 bp の範囲のフラグメントの存在を確認し、クロマチン濃度をナノドロップを使用して脱架橋画分で評価しました。免疫沈降は、ChIP CST キットのプロトコールに示されているように、2.5 μg のクロマチンを 10 μL の抗体と最終容量 500 μl (ChIP 超音波処理溶解バッファーで調整) 中で回転させながら 4 °C で 12 時間インキュベートすることにより実行しました。使用した ChIP 抗体は次のとおりです。 IgG (CST; #2729; ネガティブコントロールとして)。ヒストン H3 (CST; #4620、ポジティブコントロールとして); スマッド 2/3 (CST; #8685)。免疫沈降した断片を回収し、精製し、CST キットのプロトコールに従って脱架橋しました。 DNA の存在は、SsoADV Universal SYBR Green Supermix (Biorad) および次のプライマー (Eurogentec) を使用した QPCR (Biorad CFX Connect) によって検出されました: MAFbx プロモーター領域 -205/-319 (Fbxo32-5F: 5'TTCCTTGCTACACCCTGCTT3'; Fbxo32- 5R: 5'ACCTCTGCACCTCCCCTACT3'); MAFbx プロモーター領域 -424/-618 (Fbxo32-2F: 5'CTTCTTTCCCCTTCCTTTGC3'; Fbxo32-2R: 5'GGTAGGGGTGCATTCTTTGA3'); MAFbx 無関係プロモーター領域 -1232/-1320 (Fbxo32-7F:5'GGCCTGCCAGTACAGACAAT3'; Fbxo32-7R:5'AGGTGTCTTCCTTGCTCACG3')。 MuRF1 プロモーター領域 -608/-727: (Trim63-2F: 5'CAGCACAAGGGTGTTCATGT3'; Trim63-2R: 5'CTCAGTGGTAAAGGGGCTTG3'); MuRF1 無関係プロモーター領域 -1805/-1978: (Trim63-9F: 5' GTGGATGCCAGGAACTGAAT'; Trim63-9R: 5' GGCTGTCCTGGAACTCACTC3')。

ImageJ を使用して、微小管の組織化を垂直 (黄色のバー) と水平 (青色のバー) のラインスキャンで視覚化しました。最近開発された方向性解析ツール 81 (TeDT) を使用して、すべてのマウス系統の微小管ネットワーク格子の方向性が計算されました。二元配置分散分析を使用して、グループ間の微小管交差角度の影響を評価しました。両側 U 検定 (マン – ホイットニー) 事後測定を使用して、グループ間の差異の程度を決定しました。有意性は P < 0.05 に設定されました。

正確な分析を行うために、各画像は単一の正面 NMJ で撮影されました。視野に対して部分的に傾斜している NMJ は、傾斜部分が総面積の約 10% 未満を構成する場合にのみ含まれます。コンパクトさと断片化指数を定量化するために、「NMJ-morph」手法を使用して画像を分析しました123。終板における AChR のコンパクトさは次のように定義されました: コンパクトネス \(=\,\left(\frac{{{{{{\rm{AChR}}}}}}\; {{{{{\rm{area }}}}}}}{{{{{{\rm{エンドプレート}}}}}}\; {{{{{\rm{面積}}}}}}\right)\,\100 倍\ ）。

断片化指数は、固形プラーク状終板の指数が (0) であり、高度に断片化した終板の指数が (1) の数値に向かう傾向があるように計算されました: 断片化指数 \(=\,1-\left(\ frac{1}{{{{{\rm{number}}}}}\; {{{{{\rm{of}}}}}}\; {{{{{\rm{AChR}} }}}}\; {{{{{\rm{クラスター}}}}}}}\right)\)。

シナプス後モーター終板の基本寸法は、標準の ImageJ 機能を使用して測定されました。「NMJ-morph」は、運動終板を構成する個別の AChR クラスターの数を定量化するために使用されます。

すべての統計分析は、Prism 6.0 (GraphPad Software、ラホーヤ、米国) を使用して実行されました。ノンパラメトリックな両側 U 検定 (Mann-Whitney) が適用されました。多重要因分散分析では、二元配置分散分析が適用されました。 0.05 未満の P 値は統計的に有意であると見なされます (図では単一のアスタリスクとして示されています)。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

ソースデータはこのペーパーに付属しています。この原稿では、データの利用可能性に制限はありません。この研究で主に生成された生データは、ソースデータファイルとして補足情報に提供されます。補足図は補足情報ファイルの最後に記載されています。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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専門家の技術的支援と実りある議論をしていただいた John Lunde、Jean Luc Thomas、Amanda Tran、Laurent Coudert、Nawres Ben Marzouk、Jacques Brocard に感謝いたします。顕微鏡へのアクセスについては、リヨンの PLATIM および CIQLE 顕微鏡施設、およびオタワ大学細胞生物学および画像取得コア (RRID: SCR_021845) に感謝します。この研究の資金は、この研究の過程でAFMからの博士研究員フェローシップの恩恵を受けたBJJAOへのフランス・コントレ・レ・ミオパシー協会（AFMテレソン）からの助成金を通じて得られました。この研究に対する追加の支援は、戦略的MyoNeurALPアライアンスを通じたAFMテレソン、LSに対する「エキップFRM」資金提供による医学研究財団、およびBJJに対するカナダ保健研究所から提供されました。

これらの著者は同様に貢献しました: Bernard J. Jasmin、Laurent Schaeffer。

ニューロンと筋肉の病態生理学と遺伝学 (INMG-PGNM)、CNRS UMR 5261、INSERM U 1315、リヨン大学、リヨン、フランス

アレクシス・オッセーニ、エドウィジュ・ベロッティ、イザベラ・シオンティ、ヤン=ガエル・ガングロフ、ヴァンサン・モンコラン、レティシア・マゼラン、レミ・ムニエ、パスカル・ルブラン、ローラン・シェーファー

細胞バイオテクノロジーセンター、ホスピスシビルドゥリヨン、リヨン、フランス

アレクシス・オッセーニ & ローラン・シェーファー

医学部細胞分子医学科、451 Smyth Road、オタワ大学、オタワ、オンタリオ州、K1H 8M5、カナダ

アイメリック・ラヴェル＝シャピュイ & バーナード・J・ジャスミン

エリック・プーリン神経筋疾患センター、オタワ大学医学部、オタワ、オンタリオ州、K1H 8M5、カナダ

バーナード・J・ジャスミン

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AO、BJJ、LS は研究を発案し、プロジェクトを設計し、助成金を獲得しました。 AO と ARC は免疫蛍光法とすべての動物実験を実施しました。 AO と EB は細胞分別実験を行いました。 AO と IS は TGF-β 実験を実施しました。 AO、LM、YGG は mTOR 実験を実施しました。 AO と PL はすべてのウェスタンブロットを実行しました。 AO と VM は ChIP 実験を実施しました。 AO はすべての培養細胞実験を実施しました。 AO が図を作成しました。 1a と 6 は Adobe Illustrator で表示されます。 AO と LS は最初の草稿を書きました。 AO、ARC、EB、IS、YGG、VM、LM、RM、PL、BJJ、LS がデータを分析、解釈し、レビューし、原稿を完成させ、コメントと編集を提供しました。

Alexis Osseni、Bernard J. Jasmin、またはLaurent Schaefferとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Chiara Mozzetta と他の匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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Osseni, A.、Ravel-Chapuis, A.、Belotti, E. 他 HDAC6 の薬理学的阻害は、Smad3 アセチル化を介して TGF-β を下方制御することにより、ジストロフィン欠損マウスの筋肉表現型を改善します。 Nat Commun 13、7108 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-34831-3

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受信日: 2022 年 1 月 28 日

受理日: 2022 年 11 月 1 日

公開日: 2022 年 11 月 19 日

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